Matériels et méthodes
Activités biologiques
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- Étape 3: consiste à évaluer l’effet combiné de la vitamine E (un antioxydant fort et
stable) et des saponines (aux concentrations non hémolytiques) sur la réduction de
l’hémolyse oxydative.
III.1.3.1. Détermination des concentrations non hémolytique des saponines
Cette étape consiste à déterminer la capacité des saponines à provoquer la lyse des globules
rouges et la libération d’oxyhémoglobine (HbO2).
Les saponines sont connues comme anti-nutriments en raison de leur activité hémolytique,
cependant la toxicité des extraits naturels est dose dépendante. Par conséquent, il est crucial
de déterminer l’effet toxique des saponines sur les globules rouges quantitativement en
déterminant la EC50% et la concentration non hémolytique.
Le test de l'activité hémolytique des extraits de saponines a été effectué in cellulo, sur une
suspension érythrocytaire à 2% de sang d’un volontaire sain, selon le protocole décrit par
Apers et al., (2001) et Amzal et al., (2008) avec quelques modifications.
La solution d’érythrocyte à 2% est préparée comme suit: une quantité de sang brut citraté (10
ml) est lavée avec 40 ml d’une solution du tampon phosphate salin PBS (138 mM NaCl, 2,7
mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) dans un flacon de 50 mL, puis
centrifugée pendant 15 minutes à 10 000 tr.min
-1 . Le surnageant résultant est éliminé et la
centrifugation est renouvelée jusqu’à ce que le surnageant devient clair et sans couleur.
Chaque 1 mL du culot est récupéré dans de 49 mL de PBS pour donner une suspension
d’érythrocytes à 2 %.
Pour réaliser le test d’hémolyse 500 μL de la suspension d’érythrocytes est mélangé avec 500
μL d’extrait de saponines de différentes concentrations (de 50 à 500 mg. L
-1 ), dans des tubes
eppendorf. Les tubes sont mélangés délicatement et incubés à 37°C. Après 2 h d’incubation
les tubes sont centrifugés pendant 10 min à 1000 tr.min
-1 ). Le surnageant est récupéré et sa
densité optique est mesurée à 540 nm, en utilisant comme témoin un blanc sans extrait (PBS),
à l’aide d’un spectrophotomètre (modèle 7305, JENWAY).
La capacité hémolytique a été exprimée en pourcentage d'érythrocytes lysés, et calculée selon
l'équation suivante:
Hémolyse (%) =
𝐴𝑏𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑡 −𝐴𝑏𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒
𝐴𝑏𝑠 𝑑 ′ ℎ𝑒𝑚𝑜𝑙𝑦𝑠𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒
× 100
(𝟏𝟐) .
Avec:
Abs extrait : c’est l’absorbance de la solution formée de la suspension d’érythrocyte (500 µL) et
d’extrait de saponines (500 µL);