CHAPITRE II : Matériel et méthodes
37
1
er Isolement
Un premier isolement est réalisé, à partie du premier enrichissement, sur gélose Hektoen, qui
est un milieu d’isolement des Salmonelles, bien que de nombreuses bactéries à Gram négatif
puissent se développer ; et sur milieu SS qui est sélectif aux salmonelles.
L’identification d’entérobactéries pathogènes repose sur la non-utilisation du lactose (lactose
négatif) isolées sur ces géloses. L’incubation est effectuée à 37°C pendant 24H.
2eme Enrichissement
Un deuxième enrichissement est réalisé dans 10mldu même milieu conditionné en tubes
auquel sont ajoutés des disques SFB. L’incubation est effectuée à 37°C pendant 24h.
2eme Isolement
Il s’effectue en étalant une goutte de SFB (S/C) sur géloses Hektoen et SS.
L’identification biochimique
Des colonies de salmonelles sont transparentes, avec ou sans centre noire sur le milieu SS ; et
les colonies bleu-vert sur le milieu Hektoen.
A partir de ces colonies suspectes, quelques tests biochimiques ont été effectués :
La coloration de Gram
C’est un test signalé par Christian Gram en 1884 et reste utilisable jusqu’à l’heure actuelle. Il
permet la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram+ et les Gram- le premier se
colore en violet et le second en rose .Il y a plusieurs théories expliquant ce phénomène, la plus
retenue se base sur les différences dans la structure de la paroi de ces deux groupes Gram(+)
et Gram(-) (Figure 22).
La paroi des Gram - semble contenir 20% de lipides qui se dissolvent dans l’alcool
augmentant ainsi la perméabilité cellulaire, ce qui facilite l’élimination du premier colorant
violet du cytoplasme. La fuschine, colorant basique, permettra au Gram(-) d’acquérir une
nouvelle coloration rose.
La paroi des Gram+ ne contient que 05% de lipides, l’alcool entraîne l’élimination d’eau et le
rétrécissement des pores et donc la rétention du violet de Gentiane au niveau du cytoplasme
(Joffin et leyral.2001).
Les échantillons sont ensuite observés au microscope au grossissement 100, les salmonelles
sont des bacilles à Gram négatif (seront donc colorés en rose).
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er Isolement
Un premier isolement est réalisé, à partie du premier enrichissement, sur gélose Hektoen, qui
est un milieu d’isolement des Salmonelles, bien que de nombreuses bactéries à Gram négatif
puissent se développer ; et sur milieu SS qui est sélectif aux salmonelles.
L’identification d’entérobactéries pathogènes repose sur la non-utilisation du lactose (lactose
négatif) isolées sur ces géloses. L’incubation est effectuée à 37°C pendant 24H.
2eme Enrichissement
Un deuxième enrichissement est réalisé dans 10mldu même milieu conditionné en tubes
auquel sont ajoutés des disques SFB. L’incubation est effectuée à 37°C pendant 24h.
2eme Isolement
Il s’effectue en étalant une goutte de SFB (S/C) sur géloses Hektoen et SS.
L’identification biochimique
Des colonies de salmonelles sont transparentes, avec ou sans centre noire sur le milieu SS ; et
les colonies bleu-vert sur le milieu Hektoen.
A partir de ces colonies suspectes, quelques tests biochimiques ont été effectués :
La coloration de Gram
C’est un test signalé par Christian Gram en 1884 et reste utilisable jusqu’à l’heure actuelle. Il
permet la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram+ et les Gram- le premier se
colore en violet et le second en rose .Il y a plusieurs théories expliquant ce phénomène, la plus
retenue se base sur les différences dans la structure de la paroi de ces deux groupes Gram(+)
et Gram(-) (Figure 22).
La paroi des Gram - semble contenir 20% de lipides qui se dissolvent dans l’alcool
augmentant ainsi la perméabilité cellulaire, ce qui facilite l’élimination du premier colorant
violet du cytoplasme. La fuschine, colorant basique, permettra au Gram(-) d’acquérir une
nouvelle coloration rose.
La paroi des Gram+ ne contient que 05% de lipides, l’alcool entraîne l’élimination d’eau et le
rétrécissement des pores et donc la rétention du violet de Gentiane au niveau du cytoplasme
(Joffin et leyral.2001).
Les échantillons sont ensuite observés au microscope au grossissement 100, les salmonelles
sont des bacilles à Gram négatif (seront donc colorés en rose).