PROTIDES. PEPTIDES
65
Les acides aminés constitutifs
sont ensuite caractérisés le plus souvent par
chromatographie sur papier (p. 16_) ou séparés sur colonnes d’échangeurs d’ions
(p. 17); des eluants appropr1és déplacent chaque acide aminé séparément,
selon son pHi (méthode de Moore et Stein). Les échangeurs d’ions (p. 17) sont
contenus dans une colonne de dimension dénie. On dépose la solution
d’ac1des aminés sur les résines échangeuses d’ions et on élue ensuite chaque
acrde aminé par
un tampon dont on change progressivement la force ionique
et le pH. Les
ions du tampon prennent la place des acides aminés; ceux dont la
force
de liaison sur les résines échangeuses d’ions est faible se détachent plus
rapidement que les acides aminés dont la force de liaison est plus forte. Par
exemple en milieu acide, les acides aminés acides ou neutres sont dissociés et
portent une seule charge positive, un acide aminé basique dans les mêmes
conditions en porte deux :
_
R—CH—COOH
+HsN—R—CH—COOH
,
r]qH3+
|i1H3+
Les tampons peuvent être non volatils (citrate de sodium) ou volatils comme
le mélange pyridine—acétique. L’ordre d’élution est le suivant: acides aminés
acides, neutres, cycliques, basiques.
Expression des résultats. Les résultats de l’analyse de la composition en
aminoacides peuvent être exprimés de façons différentes :
1) On calcule les pourcentages pondéraux (g d’aminoacide/lOO g protéine),
ou le nombre de résidus pour 100 g de protéine ou pour 100 aminoacides.
2) On calcule la quantité d’azote provenant de chaque aminoacide
et on
la rapporte, soit à 100 g de protéine (la somme doit être égale au taux d’azote
dans la protéine, environ 16 p. 100, soit à 100 g d’azote total dans ce cas, la
somme doit être proche de 100).
3) On calcule à partir des pourcentages pondéraux le nombre de résidus
de chaque aminoacide par molécule de protéine; quand le P.M. de celle-cr
est connu (sinon on rapporte le nombre de résidus à une masse arbitraire de
104 ou 105 g) : on obtient la formule brute de la protéine.
20 NATURE DES ACIDES AMINÉS N ET C TERMINAUX
_
Les acides aminés N terminaux. —— L’acide aminé ayant son NH2 libre est
caractérisé le plus souvent par la méthode de Sanger : le uorodinitro-benzéne
cède un radical dinitrophényl (BNP) au NH2 terminal en libérant un acide
uorhydrique; on hydrolyse la liaison peptidique et on caractérise par chroma=
tographie ce dérivé dinitrophényl, coloré en jaune.
_______
0HrîH
£Ë————ÎÏ]HN—CH—C°W
NH_CH_CO…i…
N°2
N°2
_
-——-——-——>
_
N02
mo2
La méthode de dansylation utilise le_chlorure de dansyl ou l-diméthyI—aminonaphtalène sulfony] qui donne une réaction uorescente très sensible (p. 56).
La méthode d’Edmann, plus récente, donne de meilleurs résultats et permet
l’analyse séquentielle.
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Les acides aminés constitutifs
sont ensuite caractérisés le plus souvent par
chromatographie sur papier (p. 16_) ou séparés sur colonnes d’échangeurs d’ions
(p. 17); des eluants appropr1és déplacent chaque acide aminé séparément,
selon son pHi (méthode de Moore et Stein). Les échangeurs d’ions (p. 17) sont
contenus dans une colonne de dimension dénie. On dépose la solution
d’ac1des aminés sur les résines échangeuses d’ions et on élue ensuite chaque
acrde aminé par
un tampon dont on change progressivement la force ionique
et le pH. Les
ions du tampon prennent la place des acides aminés; ceux dont la
force
de liaison sur les résines échangeuses d’ions est faible se détachent plus
rapidement que les acides aminés dont la force de liaison est plus forte. Par
exemple en milieu acide, les acides aminés acides ou neutres sont dissociés et
portent une seule charge positive, un acide aminé basique dans les mêmes
conditions en porte deux :
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R—CH—COOH
+HsN—R—CH—COOH
,
r]qH3+
|i1H3+
Les tampons peuvent être non volatils (citrate de sodium) ou volatils comme
le mélange pyridine—acétique. L’ordre d’élution est le suivant: acides aminés
acides, neutres, cycliques, basiques.
Expression des résultats. Les résultats de l’analyse de la composition en
aminoacides peuvent être exprimés de façons différentes :
1) On calcule les pourcentages pondéraux (g d’aminoacide/lOO g protéine),
ou le nombre de résidus pour 100 g de protéine ou pour 100 aminoacides.
2) On calcule la quantité d’azote provenant de chaque aminoacide
et on
la rapporte, soit à 100 g de protéine (la somme doit être égale au taux d’azote
dans la protéine, environ 16 p. 100, soit à 100 g d’azote total dans ce cas, la
somme doit être proche de 100).
3) On calcule à partir des pourcentages pondéraux le nombre de résidus
de chaque aminoacide par molécule de protéine; quand le P.M. de celle-cr
est connu (sinon on rapporte le nombre de résidus à une masse arbitraire de
104 ou 105 g) : on obtient la formule brute de la protéine.
20 NATURE DES ACIDES AMINÉS N ET C TERMINAUX
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Les acides aminés N terminaux. —— L’acide aminé ayant son NH2 libre est
caractérisé le plus souvent par la méthode de Sanger : le uorodinitro-benzéne
cède un radical dinitrophényl (BNP) au NH2 terminal en libérant un acide
uorhydrique; on hydrolyse la liaison peptidique et on caractérise par chroma=
tographie ce dérivé dinitrophényl, coloré en jaune.
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0HrîH
£Ë————ÎÏ]HN—CH—C°W
NH_CH_CO…i…
N°2
N°2
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N02
mo2
La méthode de dansylation utilise le_chlorure de dansyl ou l-diméthyI—aminonaphtalène sulfony] qui donne une réaction uorescente très sensible (p. 56).
La méthode d’Edmann, plus récente, donne de meilleurs résultats et permet
l’analyse séquentielle.