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5 • Techniques et biotechnologies
L’utilisation d’anticorps présuppose que l’on a fait s’exprimer les
clones ADN qui ont été séparés sur boîte de Pétri. On utilise pour ce
faire des vecteurs d’expression, c’est-à-dire des Phages capables de traduire en protéines les fragments d’ADN qui leur ont été incorporés.
On identifie les complexes antigène/anticorps en liant à l’anticorps une
protéine A (qui se lie aux immunoglobulines) sur laquelle on a fixé un
isotope radioactif.
e) Blocages des ARNm, utilisation de l’ARN interférence
Depuis longtemps, on sait comment utiliser des séquences antisenses
et les introduire dans les cellules pour bloquer spécifiquement (on dit
« knock-down », KO) l’expression d’un ARNm. On a utilisé pour cela
Principales techniques utilisées
pour le criblage d’une banque ADN
1. On possède un fragment de la protéine d’intérêt :
a) fabrication d’un oligonucléotide de synthèse radioactif
à partir de la séquence en acides aminés;
b) fabrication d’un anticorps : on utilise des vecteurs
d’expression comme le phage λgt11 qu ivont fabriquer les proétines correspondant aux divers fragments ADN, l’anticorps sera rendu radioactif.
2. On ne possède pas la protéine d’intérêt :
a) hybridation des spots ADN obtenus au moyen d’une
purée d’ARNm contenant au moins le messager d’intérêt,
après lavage chaque spot va retenir son messager
spécifique qu’il conviendra ensuite de traduire in
vitro;
b) banque différentielle : l’ADNc préparé à partir des
ARNm d’un tissu A est hybridé avec l’ARNm d’un
tissu B, ce qui reste représentera le ou les gènes
exprimés dans A et pas dans B.