5.1 Quelques outils de base
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
des Phages comme vecteur permet d’augmenter les rendements et de se
servir de fragments d’ADN beaucoup plus grands. Il y a lieu d’abord de
libérer l’ADN phagique qui est normalement encapsulé. On effectue
ensuite une ligation, comme avec un plasmide, mais en rendant les
extrémités de l’insert compatibles avec celles de l’ADN phagique, et on
reconstitue la capsule phagique à partir de ses protéines. Le phage est
alors prêt à infecter les bactéries. Les cultures bactériennes doivent être
très abondantes, et sont étalées sur boîtes de Pétri, les plages claires indiqueront la lyse bactérienne. Il faudra ensuite transférer l’ADN sur une
membrane et procéder à la phase dite de criblage. Les banques ADN
peuvent être génomiques, et dans ce cas elles contiennent la totalité du
génome et peuvent donc permettre l’isolement de fragments non
codants, voir anonymes, elles peuvent être faites d’ADNc et dans ce cas
elles ne représentent que l’ADN exprimé dans un tissu donné.
d) Criblage d’une banque
Le criblage d’une banque consiste à rechercher le gène d’intérêt dans
un des spots sus-décrits. On veut par exemple isoler et connaître les
protéines présentes dans le tissu fœtal et absentes du tissu adulte, sousentendu les protéines responsables ou caractéristiques de la différenciation cellulaire. La technique consiste à préparer les ARNm totaux des
deux types de tissu. Par transcription reverse, on transforme les ARNm
du tissu fœtal en ADNc et l’on hybride ces ADNc avec les ARNm du
tissu adulte. Les ADNc spécifiques du tissu fœtal resteront monobrins
et pourront être isolés et incorporés dans un vecteur pour former une
banque. Les clones isolés à partir de cette banque pourront s’hybrider
avec les ADNc fœtaux, pas avec l’ADN adulte.
Dans la plupart des cas la protéine dont on veut isoler le gène est
connue, et, au moins partiellement isolée et séquencée. On peut alors
tirer avantage de ces données pour isoler la partie codante du gène.
Une technique très semblable consiste à cribler une banque au moyen
d’une sonde radioactive homologue, en utilisant la séquence d’une isoforme, lorsqu’elle existe. C’est la manière habituelle d’isoler les isoenzymes ou les isoformes.
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
des Phages comme vecteur permet d’augmenter les rendements et de se
servir de fragments d’ADN beaucoup plus grands. Il y a lieu d’abord de
libérer l’ADN phagique qui est normalement encapsulé. On effectue
ensuite une ligation, comme avec un plasmide, mais en rendant les
extrémités de l’insert compatibles avec celles de l’ADN phagique, et on
reconstitue la capsule phagique à partir de ses protéines. Le phage est
alors prêt à infecter les bactéries. Les cultures bactériennes doivent être
très abondantes, et sont étalées sur boîtes de Pétri, les plages claires indiqueront la lyse bactérienne. Il faudra ensuite transférer l’ADN sur une
membrane et procéder à la phase dite de criblage. Les banques ADN
peuvent être génomiques, et dans ce cas elles contiennent la totalité du
génome et peuvent donc permettre l’isolement de fragments non
codants, voir anonymes, elles peuvent être faites d’ADNc et dans ce cas
elles ne représentent que l’ADN exprimé dans un tissu donné.
d) Criblage d’une banque
Le criblage d’une banque consiste à rechercher le gène d’intérêt dans
un des spots sus-décrits. On veut par exemple isoler et connaître les
protéines présentes dans le tissu fœtal et absentes du tissu adulte, sousentendu les protéines responsables ou caractéristiques de la différenciation cellulaire. La technique consiste à préparer les ARNm totaux des
deux types de tissu. Par transcription reverse, on transforme les ARNm
du tissu fœtal en ADNc et l’on hybride ces ADNc avec les ARNm du
tissu adulte. Les ADNc spécifiques du tissu fœtal resteront monobrins
et pourront être isolés et incorporés dans un vecteur pour former une
banque. Les clones isolés à partir de cette banque pourront s’hybrider
avec les ADNc fœtaux, pas avec l’ADN adulte.
Dans la plupart des cas la protéine dont on veut isoler le gène est
connue, et, au moins partiellement isolée et séquencée. On peut alors
tirer avantage de ces données pour isoler la partie codante du gène.
Une technique très semblable consiste à cribler une banque au moyen
d’une sonde radioactive homologue, en utilisant la séquence d’une isoforme, lorsqu’elle existe. C’est la manière habituelle d’isoler les isoenzymes ou les isoformes.