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5 • Techniques et biotechnologies
Figure 44 Résultats d’une PCR quantitative.
Cette photo est une autoradiographie d’une électrophorèse
sur laquelle on a fait migrer l’ADN obtenu après amplification
par PCR. La technique consiste à ajouter au milieu d’amplification une copie mutée de la sonde que l’on souhaite amplifier. la mutation a généré dans la sonde un site de restriction
absent dans la séquence sauvage. après amplification on
traite le mélange ADN à tester/sonde mutée par l’enzyme de
restriction correspondant. La sonde mutée est facilement
repérée puisqu’elle est plus petite, ici a peu prés la moitié
puisque le site de restriction a été ajoute au milieu de la
sonde. Le dosage PCR mis au point ici concerne le messager
codant pour le récepteur de l’adrénaline, le récepteur beta1adrénergique. Le matériel de départ dans lequel on veut
faire ce dosage est l’ARN total, qui contient l’ARN messager
cardiaque. Ces ARN messagers doivent d’abord être rétrotranscrits, il s’agit donc d’une RT-PCR. Deux amorces complémentaires des extrémités du gène ont été synthétisées, elles
ont permis d’amplifier des quantités croissantes d’ADN, ici en
NG, de l’extrait de cœur, et une quantité fixe de la sonde
mutée. On obtient une bande de poids moléculaire élevé, le
gène du récepteur que l’on veut doser qui ne forme qu’une
bande puisqu’il ne contient pas le site de restriction, et deux
bandes plus petites correspondant aux deux fragments de la
sonde mutée. La réponse est dose-dépendante pour l’ADN
étudié. elle ne l’est pas pour la sonde mutée dont la quantité
est toujours la même (document CEA/INSERM, dû à l’obligeance de M. Elalouf et de J.-M. Moalic).
5 • Techniques et biotechnologies
Figure 44 Résultats d’une PCR quantitative.
Cette photo est une autoradiographie d’une électrophorèse
sur laquelle on a fait migrer l’ADN obtenu après amplification
par PCR. La technique consiste à ajouter au milieu d’amplification une copie mutée de la sonde que l’on souhaite amplifier. la mutation a généré dans la sonde un site de restriction
absent dans la séquence sauvage. après amplification on
traite le mélange ADN à tester/sonde mutée par l’enzyme de
restriction correspondant. La sonde mutée est facilement
repérée puisqu’elle est plus petite, ici a peu prés la moitié
puisque le site de restriction a été ajoute au milieu de la
sonde. Le dosage PCR mis au point ici concerne le messager
codant pour le récepteur de l’adrénaline, le récepteur beta1adrénergique. Le matériel de départ dans lequel on veut
faire ce dosage est l’ARN total, qui contient l’ARN messager
cardiaque. Ces ARN messagers doivent d’abord être rétrotranscrits, il s’agit donc d’une RT-PCR. Deux amorces complémentaires des extrémités du gène ont été synthétisées, elles
ont permis d’amplifier des quantités croissantes d’ADN, ici en
NG, de l’extrait de cœur, et une quantité fixe de la sonde
mutée. On obtient une bande de poids moléculaire élevé, le
gène du récepteur que l’on veut doser qui ne forme qu’une
bande puisqu’il ne contient pas le site de restriction, et deux
bandes plus petites correspondant aux deux fragments de la
sonde mutée. La réponse est dose-dépendante pour l’ADN
étudié. elle ne l’est pas pour la sonde mutée dont la quantité
est toujours la même (document CEA/INSERM, dû à l’obligeance de M. Elalouf et de J.-M. Moalic).