5.1 Quelques outils de base
105
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
blot » consiste à faire migrer en électrophorèse sur un gel les fragments
de l’ADN obtenus par l’action d’enzymes de restriction. À la fin de la
migration les séquences nucléotidiques sont transférées sur une membrane et hybridées à une sonde spécifique.
L’existence d’une mutation change de façon imprévisible la carte de
restriction, comme on peut le voir figure 40. Le nombre de bandes
observées, et donc la finesse de l’outil, est proportionnel au nombre de
sites de restriction et au nombre d’enzymes utilisés en même temps,
une mutation peut aussi bien créer une bande nouvelle qu’en enlever
une autre. L’existence d’un allèle, même s’il ne s’agit que d’un seul
allèle donne des aspects très différents selon qu’il s’agit d’un homo- ou
d’un hétérozygote. Les cartes de restriction ne sont plus guère utilisées
en génétique.
c) Séquençage
Le séquençage d’un fragment d’ADN ou d’ARN est actuellement
facile, rapide et se fait en pratique automatiquement. Il est beaucoup
plus facile que le séquençage d’une protéine, ce qui fait que l’on a souvent eu la séquence d’un gène, ou tout au moins de la partie codante
d’un gène, bien avant celle de la protéine. La méthode de Sanger est
actuellement la méthode de référence. Elle consiste, dans son principe
à synthétiser un fragment de l’ADN que l’on souhaite séquencer à
partir d’une sonde-amorce dont une extrémité est marquée (rond vert
figure 41) et à interrompre de façon aléatoire cette synthèse au moyen
de ddTTP, ddATP, ddCTP et ddGTP marqués. De simples électrophorèses permettront de lire la séquence comme indiqué figure 41. La
méthode est automatisée, elle permet des recoupements et des alignements de séquence. Les résultats en sont généralement rendus sous
forme de courbes de couleur différentes, chaque courbe correspondant à une base. D’autres méthodes existent (voir Gibson 2004 et
Griffiths 2004).
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
blot » consiste à faire migrer en électrophorèse sur un gel les fragments
de l’ADN obtenus par l’action d’enzymes de restriction. À la fin de la
migration les séquences nucléotidiques sont transférées sur une membrane et hybridées à une sonde spécifique.
L’existence d’une mutation change de façon imprévisible la carte de
restriction, comme on peut le voir figure 40. Le nombre de bandes
observées, et donc la finesse de l’outil, est proportionnel au nombre de
sites de restriction et au nombre d’enzymes utilisés en même temps,
une mutation peut aussi bien créer une bande nouvelle qu’en enlever
une autre. L’existence d’un allèle, même s’il ne s’agit que d’un seul
allèle donne des aspects très différents selon qu’il s’agit d’un homo- ou
d’un hétérozygote. Les cartes de restriction ne sont plus guère utilisées
en génétique.
c) Séquençage
Le séquençage d’un fragment d’ADN ou d’ARN est actuellement
facile, rapide et se fait en pratique automatiquement. Il est beaucoup
plus facile que le séquençage d’une protéine, ce qui fait que l’on a souvent eu la séquence d’un gène, ou tout au moins de la partie codante
d’un gène, bien avant celle de la protéine. La méthode de Sanger est
actuellement la méthode de référence. Elle consiste, dans son principe
à synthétiser un fragment de l’ADN que l’on souhaite séquencer à
partir d’une sonde-amorce dont une extrémité est marquée (rond vert
figure 41) et à interrompre de façon aléatoire cette synthèse au moyen
de ddTTP, ddATP, ddCTP et ddGTP marqués. De simples électrophorèses permettront de lire la séquence comme indiqué figure 41. La
méthode est automatisée, elle permet des recoupements et des alignements de séquence. Les résultats en sont généralement rendus sous
forme de courbes de couleur différentes, chaque courbe correspondant à une base. D’autres méthodes existent (voir Gibson 2004 et
Griffiths 2004).