112
48 Leschromatographies
Mots clés
Gel perméation, chromatographies d’affinité, d’échange d’ion, hydrophobe
1. GÉNÉRALITÉS
Le terme chromatographie, proposé par Mikhail Tswett en 1903, désigne un ensemble
de techniques de séparation qui reposent sur l’affinité différentielle des molécules d’un
mélange pour une phase stationnaire ou matrice, solide et une phase mobile, liquide ou
gazeuse.
Dans le cas des protéines, le mélange est déposé au sommet de la phase stationnaire
contenue dans une colonne. La phase mobile, un éluant, traverse la phase stationnaire et
entraîne progressivement les molécules vers le bas de la colonne où l’effluent est collecté
en différentes fractions qui sont ensuite analysées.
Selon le type de matrice, les molécules de protéines sont retenues et retardées par la
colonne en fonction de paramètres physico-chimiques variés : taille, charge électrique,
hydrophobicité de la surface ou affinité pour des ligands déterminés.
2. CHROMATOGRAPHIE PAR FILTRATION SUR GEL
Cette technique chromatographique est également nommée chromatographie par exclusion ou chromatographie par tamisage moléculaire. Dans cette technique, les molécules
sont séparées selon leur taille et leur forme. L’échantillon est déposé au sommet d’une
colonne de gel constitué de billes de porosité définie. Ces billes sont constituées de
dextran (polymère de glucose), d’agarose (polymère de dérivés du galactose) ou de polyacrylamide. Les molécules de petite taille (petites protéines et polypeptides) pénètrent
dans les billes et sont donc retardées, alors que les molécules de taille supérieure à celle
des pores ne pénètrent pas dans les billes et traversent donc plus rapidement la colonne.
3. CHROMATOGRAPHIE PAR ÉCHANGE D’IONS
Dans cette chromatographie, la matrice (cellulose, polystyrène, agarose, dextran)
contient des groupes ionisés qui fixent des ions de charge opposée (A + , B – ) présents dans
la solution ; ces ions pourront être échangés avec des protéines. On distingue les échangeurs d’anions (matrice R chargée positivement) et les échangeurs de cations (matrice
chargée négativement) :
Échangeurs d’anions : R + B – + Prot – 8 R + Prot – + B –
Échangeurs de cations : R – A + + Prot+ 8 R – Prot+ + A +
Les protéines se fixent à la matrice en fonction de leur affinité pour les groupes ionisés.
La colonne est ensuite lavée avec un tampon (tampon d’élution), qui entraine en premier
lieu les protéines les plus faiblement liées à l’échangeur. Les protéines les plus fortement
liées seront libérées en dernier ou resteront fixées sur la matrice. On réussit en général à
libérer l’ensemble des protéines fixées en faisant varier le pH du tampon d’élution ou en
augmentant progressivement sa force ionique.
9782100724185-Livre.indb 112
20/05/15 19:11
48 Leschromatographies
Mots clés
Gel perméation, chromatographies d’affinité, d’échange d’ion, hydrophobe
1. GÉNÉRALITÉS
Le terme chromatographie, proposé par Mikhail Tswett en 1903, désigne un ensemble
de techniques de séparation qui reposent sur l’affinité différentielle des molécules d’un
mélange pour une phase stationnaire ou matrice, solide et une phase mobile, liquide ou
gazeuse.
Dans le cas des protéines, le mélange est déposé au sommet de la phase stationnaire
contenue dans une colonne. La phase mobile, un éluant, traverse la phase stationnaire et
entraîne progressivement les molécules vers le bas de la colonne où l’effluent est collecté
en différentes fractions qui sont ensuite analysées.
Selon le type de matrice, les molécules de protéines sont retenues et retardées par la
colonne en fonction de paramètres physico-chimiques variés : taille, charge électrique,
hydrophobicité de la surface ou affinité pour des ligands déterminés.
2. CHROMATOGRAPHIE PAR FILTRATION SUR GEL
Cette technique chromatographique est également nommée chromatographie par exclusion ou chromatographie par tamisage moléculaire. Dans cette technique, les molécules
sont séparées selon leur taille et leur forme. L’échantillon est déposé au sommet d’une
colonne de gel constitué de billes de porosité définie. Ces billes sont constituées de
dextran (polymère de glucose), d’agarose (polymère de dérivés du galactose) ou de polyacrylamide. Les molécules de petite taille (petites protéines et polypeptides) pénètrent
dans les billes et sont donc retardées, alors que les molécules de taille supérieure à celle
des pores ne pénètrent pas dans les billes et traversent donc plus rapidement la colonne.
3. CHROMATOGRAPHIE PAR ÉCHANGE D’IONS
Dans cette chromatographie, la matrice (cellulose, polystyrène, agarose, dextran)
contient des groupes ionisés qui fixent des ions de charge opposée (A + , B – ) présents dans
la solution ; ces ions pourront être échangés avec des protéines. On distingue les échangeurs d’anions (matrice R chargée positivement) et les échangeurs de cations (matrice
chargée négativement) :
Échangeurs d’anions : R + B – + Prot – 8 R + Prot – + B –
Échangeurs de cations : R – A + + Prot+ 8 R – Prot+ + A +
Les protéines se fixent à la matrice en fonction de leur affinité pour les groupes ionisés.
La colonne est ensuite lavée avec un tampon (tampon d’élution), qui entraine en premier
lieu les protéines les plus faiblement liées à l’échangeur. Les protéines les plus fortement
liées seront libérées en dernier ou resteront fixées sur la matrice. On réussit en général à
libérer l’ensemble des protéines fixées en faisant varier le pH du tampon d’élution ou en
augmentant progressivement sa force ionique.
9782100724185-Livre.indb 112
20/05/15 19:11