Fiche 46 • Purification des protéines
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2. TECHNIQUES DE DOSAGE DES PROTÉINES
Plusieurs techniques sont employées pour mesurer la quantité totale de protéine d’un
mélange.
• Mesure de l’absorbance à 280 nm, basée sur l’absorption de la lumière par le tryptophane et la tyrosine. Cette méthode est très rapide, mais il faut l’utiliser avec
discernement car les proportions de tyrosine et de tryptophane sont différentes d’une
protéine à l’autre (certaines protéines sont dépourvues de tryptophane).
• Méthode du biuret basée sur la formation en milieu alcalin d’un complexe rouge entre
les peptides possédant au moins 2 liaisons peptidiques et ses ions cuivre II. L’absorbance à 540 nm est proportionnelle à la quantité de protéine présente (Fiche 14).
• Méthode de Bradford basée sur l’adsorption du bleu de Coomassie G-250 sur les protéines en milieu méthanolique acide. La formation des complexes « protéine-G250 »
provoque le glissement de la bande d’adsorption du G250, de 470 à 595 nm ; la solution, initialement brun-rouge prend une teinte bleue dont l’intensité augmente avec la
concentration de protéines.
L’efficacité de la purification sera suivie en déterminant l’activité spécifique de la solution,
qui correspond au quotient de l’activité enzymatique par la quantité totale de protéines
présentes dans le mélange. Pour une enzyme pure, l’activité spécifique sera constante et
maximum. Les propriétés physico-chimiques et les caractéristiques des protéines exploitées au cours de leur purification sont résumées dans le tableau suivant :
Propriété
Technique employée
Fiche
Solubilité
Précipitation fractionnée (salting in - salting out)
46
Charge électrique
Chromatographie par échange d’ions
47
Polarité
Chromatographie par interactions hydrophobes
47
Taille
Chromatographie par filtration sur gel ou chromatographie d’exclusrion
47
Affinité pour un ligand
Chromatographie d’affinité
47
9782100724185-Livre.indb 109
20/05/15 19:11
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2. TECHNIQUES DE DOSAGE DES PROTÉINES
Plusieurs techniques sont employées pour mesurer la quantité totale de protéine d’un
mélange.
• Mesure de l’absorbance à 280 nm, basée sur l’absorption de la lumière par le tryptophane et la tyrosine. Cette méthode est très rapide, mais il faut l’utiliser avec
discernement car les proportions de tyrosine et de tryptophane sont différentes d’une
protéine à l’autre (certaines protéines sont dépourvues de tryptophane).
• Méthode du biuret basée sur la formation en milieu alcalin d’un complexe rouge entre
les peptides possédant au moins 2 liaisons peptidiques et ses ions cuivre II. L’absorbance à 540 nm est proportionnelle à la quantité de protéine présente (Fiche 14).
• Méthode de Bradford basée sur l’adsorption du bleu de Coomassie G-250 sur les protéines en milieu méthanolique acide. La formation des complexes « protéine-G250 »
provoque le glissement de la bande d’adsorption du G250, de 470 à 595 nm ; la solution, initialement brun-rouge prend une teinte bleue dont l’intensité augmente avec la
concentration de protéines.
L’efficacité de la purification sera suivie en déterminant l’activité spécifique de la solution,
qui correspond au quotient de l’activité enzymatique par la quantité totale de protéines
présentes dans le mélange. Pour une enzyme pure, l’activité spécifique sera constante et
maximum. Les propriétés physico-chimiques et les caractéristiques des protéines exploitées au cours de leur purification sont résumées dans le tableau suivant :
Propriété
Technique employée
Fiche
Solubilité
Précipitation fractionnée (salting in - salting out)
46
Charge électrique
Chromatographie par échange d’ions
47
Polarité
Chromatographie par interactions hydrophobes
47
Taille
Chromatographie par filtration sur gel ou chromatographie d’exclusrion
47
Affinité pour un ligand
Chromatographie d’affinité
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