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46 Purificationdesprotéines
Mots clés
Précipitation fractionnée, chromatographie, électrophorèse, dosage des protéines
1. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES
La purification d’une protéine s’effectue suite à divers processus, indépendants les uns
des autres, basés sur les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine considérée. À chaque étape, on tentera de conserver la protéine d’intérêt dans une partie de
l’échantillon (une fraction) en éliminant les autres protéines dites contaminantes (dans
une autre fraction de l’échantillon).
La purification est dite préparative quand la quantité de protéine désirée est élevée en
fin de purification (production industrielle de protéines telles que l’insuline, etc.). Elle
sera dite analytique quand la quantité de protéine désirée est faible en fin de purification
(production au laboratoire pour les analyses biochimiques de la protéine).
Préalablement à la purification proprement dite, différentes questions stratégiques doivent être examinées afin d’optimiser le protocole :
• Le choix du matériel de départ. Ce choix doit tenir compte de divers critères tels que
la disponibilité du matériel de départ et sa facilité d’obtention, sa richesse en protéine
concernée. Avec l’explosion des techniques de biologie moléculaire, il est possible de
faire exprimer (et sur-exprimer) pratiquement n’importe quel gène dans un organisme
approprié (E. coli, levure, cellules eucaryotes). Cette approche permet d’obtenir de
fortes quantités de la protéine désirée généralement modifiée (queue poly-histidine)
pour être rapidement et facilement purifiable.
• Le choix de la technique de solubilisation. Bien souvent, les protéines sont intracellulaires ou enchassées dans les membranes. Dans le cas de protéines cellulaires,
une lyse des cellules pourra être réalisée par choc osmotique ou mécaniquement par
l’utilisation d’homogénéiseur, d’une presse de French ou d’un sonicateur. Si la protéine
est membranaire, un fractionnement sub-cellulaire pourra être réalisé par ultracentrifugations différentielles, suivies d’une extraction de la protéine par traitement
avec des solutions salines concentrées ou des détergents.
• Le choix de la méthode de stabilisation des protéines. La protéine est purifiée et
stockée à 4 °C, dans une solution tampon pour maintenir le pH, à laquelle on ajoute
éventuellement un inhibiteur irréversible de protéases (fluorure de phénylméthanesulfonyle ou PMSF) et/ou un agent bactéricide (azoture de sodium, NaN 3 ).
• La quantification spécifique de la protéine. La purification d’une protéine nécessite
d’être capable de la déceler lors des différentes étapes de purification. Deux méthodes
sont envisageables pour déceler une protéine. Si celle-ci est une enzyme par la mesure
de son activité ; autrement, on devra détecter la protéine à l’aide de molécules qui la
reconnaissent spécifiquement (anticorps, lectines, etc.).
9782100724185-Livre.indb 108
20/05/15 19:11
46 Purificationdesprotéines
Mots clés
Précipitation fractionnée, chromatographie, électrophorèse, dosage des protéines
1. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES
La purification d’une protéine s’effectue suite à divers processus, indépendants les uns
des autres, basés sur les différentes propriétés physico-chimiques de la protéine considérée. À chaque étape, on tentera de conserver la protéine d’intérêt dans une partie de
l’échantillon (une fraction) en éliminant les autres protéines dites contaminantes (dans
une autre fraction de l’échantillon).
La purification est dite préparative quand la quantité de protéine désirée est élevée en
fin de purification (production industrielle de protéines telles que l’insuline, etc.). Elle
sera dite analytique quand la quantité de protéine désirée est faible en fin de purification
(production au laboratoire pour les analyses biochimiques de la protéine).
Préalablement à la purification proprement dite, différentes questions stratégiques doivent être examinées afin d’optimiser le protocole :
• Le choix du matériel de départ. Ce choix doit tenir compte de divers critères tels que
la disponibilité du matériel de départ et sa facilité d’obtention, sa richesse en protéine
concernée. Avec l’explosion des techniques de biologie moléculaire, il est possible de
faire exprimer (et sur-exprimer) pratiquement n’importe quel gène dans un organisme
approprié (E. coli, levure, cellules eucaryotes). Cette approche permet d’obtenir de
fortes quantités de la protéine désirée généralement modifiée (queue poly-histidine)
pour être rapidement et facilement purifiable.
• Le choix de la technique de solubilisation. Bien souvent, les protéines sont intracellulaires ou enchassées dans les membranes. Dans le cas de protéines cellulaires,
une lyse des cellules pourra être réalisée par choc osmotique ou mécaniquement par
l’utilisation d’homogénéiseur, d’une presse de French ou d’un sonicateur. Si la protéine
est membranaire, un fractionnement sub-cellulaire pourra être réalisé par ultracentrifugations différentielles, suivies d’une extraction de la protéine par traitement
avec des solutions salines concentrées ou des détergents.
• Le choix de la méthode de stabilisation des protéines. La protéine est purifiée et
stockée à 4 °C, dans une solution tampon pour maintenir le pH, à laquelle on ajoute
éventuellement un inhibiteur irréversible de protéases (fluorure de phénylméthanesulfonyle ou PMSF) et/ou un agent bactéricide (azoture de sodium, NaN 3 ).
• La quantification spécifique de la protéine. La purification d’une protéine nécessite
d’être capable de la déceler lors des différentes étapes de purification. Deux méthodes
sont envisageables pour déceler une protéine. Si celle-ci est une enzyme par la mesure
de son activité ; autrement, on devra détecter la protéine à l’aide de molécules qui la
reconnaissent spécifiquement (anticorps, lectines, etc.).
9782100724185-Livre.indb 108
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