population non synchrone, les cellules en fonction
de leur stade dans le cycle cellulaire (G 1 , S, G 2 );le
résultat se présente sous la forme d’un histogramme monoparamétrique (en fonction de la
teneur en ADN) ou bien d’un diagramme biparamétrique, quand des corrélations entre paramètres
sont possibles (voir chapitre 13).
Un dispositif de type vibrateur ultrasonique
permet aussi de fractionner la veine liquide en
microgouttelettes contenant une seule cellule ;
chaque gouttelette identifiée peut alors être affectée d’une charge électrique positive, négative ou
nulle, selon la nature ou l’intensité du signal reçu
par le détecteur optique. L’intérêt de cette opération est que des gouttelettes différemment chargées
peuvent être plus ou moins déviées et séparées les
unes des autres dans un puissant champ électrique
établi entre deux plaques déflectrices : on réalise
ainsi un triage cellulaire. Ceci permet de récupérer dans des récipients distincts des populations
cellulaires éventuellement viables, possédant des
caractéristiques de fluorescence bien précises. Le
traitement d’une cellule ne demandant qu’une
milliseconde, il est possible d’étudier des populations considérables en peu de temps.
D’autres objets biologiques que des cellules sont
séparables par l’appareil, en particulier des chromosomes isolés qui peuvent être classés selon leur
contenu en ADN ;c eci constitue un préalable
important dans les études sur le génome des cellules eucaryotiques. Le triage cellulaire apparaît
donc comme une technique extrêmement puissante au service de la biologie cellulaire.
3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
71
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
R ÉSUMÉ
L’étude des constituants cellulaires est menée à
deux niveaux et selon deux types de méthodes,
statiques ou dynamiques : les premières identifient
et localisent avec précision les molécules constitutives des structures cellulaires, les secondes étudient
leurs modifications chimiques ou leurs déplacements au sein des organites ou des cellules.
Le fractionnement chimique permet de distinguer
les grandes familles de molécules minérales ou
organiques (précurseurs et macromolécules : protéines, polysaccharides et acides nucléiques). La
chromatographie et l’électrophorèse, avec toutes
leurs variantes, constituent de puissantes techniques conduisant à l’isolement et à la purification
des biomolécules;d e même, des macromolécules
ou des édifices supramoléculaires de grande taille
(ribosomes, Virus…), sont séparés grâce à l’ultracentrifugation en gradient de saccharose ou de
CsCl. Enfin, les diverses macromolécules sont
visualisables au niveau des structures grâce aux
méthodes de la cytochimie, mais on peut aussi
détecter avec précision des espèces individuelles
de protéines ou d’acides nucléiques au moyen de
sondes immunologiques (immunocytochimie) ou
nucléiques (hybridation in situ).
Une étude exhaustive nécessite la purification des
organites et la mise en œuvre des techniques du
fractionnement cellulaire : après homogénéisation
des cellules, les différents organites ou édifices
supramoléculaires sont séparés les uns des autres
par des centrifugations successives. L’observation
directe des macromolécules isolées et purifiées est
enfin possible lorsque la coloration négative,
l’ombrage métallique ou la microscopie à effet tunnel sont utilisés. Le fonctionnement des cellules est
abordé sur des systèmes biologiques simplifiés,
homogènes et reproductibles, tels que les cultures
pures de cellules animales, végétales ou de microorganismes. L’obtention de lignées mutantes et la
possibilité de mettre en œuvre les démarches de la
génétique classique et moléculaire conduisent à
«décortiquer» un grand nombre de fonctions capitales dans la vie des cellules : cycle cellulaire, synthèse et sécrétion des protéines…
Les précurseurs radioactifs constituent un outil
irremplaçable pour l’étude de la physiologie cellulaire, en raison de la sensibilité de détection des
molécules marquées, aussi bien dans des extraits
biologiques (comptage à scintillation) que dans
des structures cellulaires (autoradiographie). Les
expériences de pulse-chase permettent de suivre le
devenir d’une population de macromolécules marquées pendant un temps très bref. Certaines activités physiologiques sont directement visualisables
dans les cellules vivantes, grâce aux techniques de
la cytoenzymologie et à l’utilisation de sondes fluorescentes d’activités métaboliques ;c ette approche
est donc complémentaire de la précédente.
de leur stade dans le cycle cellulaire (G 1 , S, G 2 );le
résultat se présente sous la forme d’un histogramme monoparamétrique (en fonction de la
teneur en ADN) ou bien d’un diagramme biparamétrique, quand des corrélations entre paramètres
sont possibles (voir chapitre 13).
Un dispositif de type vibrateur ultrasonique
permet aussi de fractionner la veine liquide en
microgouttelettes contenant une seule cellule ;
chaque gouttelette identifiée peut alors être affectée d’une charge électrique positive, négative ou
nulle, selon la nature ou l’intensité du signal reçu
par le détecteur optique. L’intérêt de cette opération est que des gouttelettes différemment chargées
peuvent être plus ou moins déviées et séparées les
unes des autres dans un puissant champ électrique
établi entre deux plaques déflectrices : on réalise
ainsi un triage cellulaire. Ceci permet de récupérer dans des récipients distincts des populations
cellulaires éventuellement viables, possédant des
caractéristiques de fluorescence bien précises. Le
traitement d’une cellule ne demandant qu’une
milliseconde, il est possible d’étudier des populations considérables en peu de temps.
D’autres objets biologiques que des cellules sont
séparables par l’appareil, en particulier des chromosomes isolés qui peuvent être classés selon leur
contenu en ADN ;c eci constitue un préalable
important dans les études sur le génome des cellules eucaryotiques. Le triage cellulaire apparaît
donc comme une technique extrêmement puissante au service de la biologie cellulaire.
3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
71
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
R ÉSUMÉ
L’étude des constituants cellulaires est menée à
deux niveaux et selon deux types de méthodes,
statiques ou dynamiques : les premières identifient
et localisent avec précision les molécules constitutives des structures cellulaires, les secondes étudient
leurs modifications chimiques ou leurs déplacements au sein des organites ou des cellules.
Le fractionnement chimique permet de distinguer
les grandes familles de molécules minérales ou
organiques (précurseurs et macromolécules : protéines, polysaccharides et acides nucléiques). La
chromatographie et l’électrophorèse, avec toutes
leurs variantes, constituent de puissantes techniques conduisant à l’isolement et à la purification
des biomolécules;d e même, des macromolécules
ou des édifices supramoléculaires de grande taille
(ribosomes, Virus…), sont séparés grâce à l’ultracentrifugation en gradient de saccharose ou de
CsCl. Enfin, les diverses macromolécules sont
visualisables au niveau des structures grâce aux
méthodes de la cytochimie, mais on peut aussi
détecter avec précision des espèces individuelles
de protéines ou d’acides nucléiques au moyen de
sondes immunologiques (immunocytochimie) ou
nucléiques (hybridation in situ).
Une étude exhaustive nécessite la purification des
organites et la mise en œuvre des techniques du
fractionnement cellulaire : après homogénéisation
des cellules, les différents organites ou édifices
supramoléculaires sont séparés les uns des autres
par des centrifugations successives. L’observation
directe des macromolécules isolées et purifiées est
enfin possible lorsque la coloration négative,
l’ombrage métallique ou la microscopie à effet tunnel sont utilisés. Le fonctionnement des cellules est
abordé sur des systèmes biologiques simplifiés,
homogènes et reproductibles, tels que les cultures
pures de cellules animales, végétales ou de microorganismes. L’obtention de lignées mutantes et la
possibilité de mettre en œuvre les démarches de la
génétique classique et moléculaire conduisent à
«décortiquer» un grand nombre de fonctions capitales dans la vie des cellules : cycle cellulaire, synthèse et sécrétion des protéines…
Les précurseurs radioactifs constituent un outil
irremplaçable pour l’étude de la physiologie cellulaire, en raison de la sensibilité de détection des
molécules marquées, aussi bien dans des extraits
biologiques (comptage à scintillation) que dans
des structures cellulaires (autoradiographie). Les
expériences de pulse-chase permettent de suivre le
devenir d’une population de macromolécules marquées pendant un temps très bref. Certaines activités physiologiques sont directement visualisables
dans les cellules vivantes, grâce aux techniques de
la cytoenzymologie et à l’utilisation de sondes fluorescentes d’activités métaboliques ;c ette approche
est donc complémentaire de la précédente.