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B IOLOGIE CELLULAIRE
formuler un modèle universel chez les Eucaryotes
(voir chapitre 13). L’approche moléculaire relativement aisée chez ce micro-organisme a permis de
développer des outils (en particulier des sondes
d’ADN) qui ont été transférés avec succès à des
organismes plus complexes, ce qui a conduit rapidement à élargir le champ de cette problématique.
•L’organisation du génome mitochondrial, son
expression, sa réplication et surtout la biogenèse
complexe de ces organites ont été finement analysées grâce à de nombreuses mutations portées par
l’ADNmt. Ces mutations, à transmission non mendélienne et létales chez les autres organismes eucaryotiques, sont en effet analysables chez la levure
qui a la possibilité unique de se passer de ses mitochondries pour son métabolisme énergétique
(grâce à la fermentation alcoolique).
•L e processus de sécrétion des protéines,
impliquant le réticulum endoplasmique rugueux
et l’appareil de G OLGI, est depuis peu de temps
analysé au moyen de mutants présentant des anomalies de ces mécanismes (voir chapitre 9).
Dans un domaine qui déborde un peu la biologie
cellulaire, il faut enfin signaler l’existence des
mutations touchant le développement embryonnaire animal ou végétal, principalement chez la
drosophile et chez Arabidopsis (une crucifère). Cette
dernière catégorie de mutations (dites homéotiques) représente un nouveau moyen très performant pour comprendre les mécanismes régissant
le développement précoce des Eucaryotes pluricellulaires. La possibilité de provoquer des mutations
dirigées, c’est-à-dire ciblées vers des gènes précis
mais dont le rôle est mal connu, pour en déduire
leur fonctionnement normal, constitue le dernier
outil mis au point dans ce domaine ;c ette technique, développée initialement chez la levure, a
été transférée avec succès chez la souris.
2.7. Extraits acellulaires assurant
des fonctions biologiques complexes
Les premiers systèmes in vitro ont été les tests
enzymatiques mis au point par les biochimistes ;
ils permettaient l’étude de réactions simples dans
des conditions bien contrôlées. Cette approche a
été complétée par celle du fractionnement cellulaire, qui a conduit à intégrer toutes ces réactions
au sein d’organites ou de structures vésiculaires
plus ou moins compliqués. L’étape suivante a
consisté à mettre au point des systèmes acellulaires
autorisant l’étude de processus biochimiques complexes. Ces extraits sont tirés d’organites, qui ont
eux-mêmes été fractionnés de manière à conserver
des fonctions physiologiques nécessitant de gros
édifices supramoléculaires.
Parmi ces activités, on peut mentionner : la synthèse des protéines sur les ribosomes (avec ou sans
microsomes), les mécanismes de réplication de
l’ADN qui impliquent de très gros complexes enzymatiques, les processus de maturation des ARN
chez les Eucaryotes, l’importation post-traductionnelle des protéines dans les organites, divers processus d’autoassemblage. Des fonctions aussi
élaborées que le battement ciliaire, la contraction
musculaire, la migration de vésicules le long des
microtubules, sont actuellement approchées par de
tels systèmes. L’intérêt considérable de ces outils
est qu’on peut, dans la mesure où ils ont été suffisamment simplifiés, les décomposer ensuite en
leurs éléments constitutifs et tester ceux-ci séparément dans des expériences de reconstitution ;p lusieurs d’entre eux seront décrits dans cet ouvrage.
2.8. Cytofluorimétrie en flux
et triage de cellules
Cette technique optique, appelée aussi cytométrie en flux continu, s’applique à des populations
de cellules isolées en suspension (organismes unicellulaires, cellules animales en culture, cellules
provenant d’un tissu mais dissociées enzymatiquement, protoplastes de cellules végétales…) et
permet de les analyser individuellement, de
manière automatique, par rapport à toute propriété pouvant impliquer une fluorescence. Le
principe consiste à marquer spécifiquement les cellules à sélectionner dans la population grâce à un
colorant fluorescent, qui peut être un anticorps
dirigé contre une protéine de surface (et auquel un
fluorochromeaété greffé), ou bien un composé se
fixant à l’ADN du noyau et responsable d’une
fluorescence (BET ou DAPI).
L’appareil utilisé comporte un système injectant, sous pression, la culture cellulaire ainsi traitée dans une buse très étroite, conçue de telle sorte
que les cellules défilent une à une devant une
petite fenêtre traversée par un fin faisceau laser de
longueur d’onde appropriée. La lumière réémise
par les cellules marquées est analysée et mesurée
par des photomultiplicateurs. Dans le cas d’un
marquage des noyaux, on peut identifier, dans une
B IOLOGIE CELLULAIRE
formuler un modèle universel chez les Eucaryotes
(voir chapitre 13). L’approche moléculaire relativement aisée chez ce micro-organisme a permis de
développer des outils (en particulier des sondes
d’ADN) qui ont été transférés avec succès à des
organismes plus complexes, ce qui a conduit rapidement à élargir le champ de cette problématique.
•L’organisation du génome mitochondrial, son
expression, sa réplication et surtout la biogenèse
complexe de ces organites ont été finement analysées grâce à de nombreuses mutations portées par
l’ADNmt. Ces mutations, à transmission non mendélienne et létales chez les autres organismes eucaryotiques, sont en effet analysables chez la levure
qui a la possibilité unique de se passer de ses mitochondries pour son métabolisme énergétique
(grâce à la fermentation alcoolique).
•L e processus de sécrétion des protéines,
impliquant le réticulum endoplasmique rugueux
et l’appareil de G OLGI, est depuis peu de temps
analysé au moyen de mutants présentant des anomalies de ces mécanismes (voir chapitre 9).
Dans un domaine qui déborde un peu la biologie
cellulaire, il faut enfin signaler l’existence des
mutations touchant le développement embryonnaire animal ou végétal, principalement chez la
drosophile et chez Arabidopsis (une crucifère). Cette
dernière catégorie de mutations (dites homéotiques) représente un nouveau moyen très performant pour comprendre les mécanismes régissant
le développement précoce des Eucaryotes pluricellulaires. La possibilité de provoquer des mutations
dirigées, c’est-à-dire ciblées vers des gènes précis
mais dont le rôle est mal connu, pour en déduire
leur fonctionnement normal, constitue le dernier
outil mis au point dans ce domaine ;c ette technique, développée initialement chez la levure, a
été transférée avec succès chez la souris.
2.7. Extraits acellulaires assurant
des fonctions biologiques complexes
Les premiers systèmes in vitro ont été les tests
enzymatiques mis au point par les biochimistes ;
ils permettaient l’étude de réactions simples dans
des conditions bien contrôlées. Cette approche a
été complétée par celle du fractionnement cellulaire, qui a conduit à intégrer toutes ces réactions
au sein d’organites ou de structures vésiculaires
plus ou moins compliqués. L’étape suivante a
consisté à mettre au point des systèmes acellulaires
autorisant l’étude de processus biochimiques complexes. Ces extraits sont tirés d’organites, qui ont
eux-mêmes été fractionnés de manière à conserver
des fonctions physiologiques nécessitant de gros
édifices supramoléculaires.
Parmi ces activités, on peut mentionner : la synthèse des protéines sur les ribosomes (avec ou sans
microsomes), les mécanismes de réplication de
l’ADN qui impliquent de très gros complexes enzymatiques, les processus de maturation des ARN
chez les Eucaryotes, l’importation post-traductionnelle des protéines dans les organites, divers processus d’autoassemblage. Des fonctions aussi
élaborées que le battement ciliaire, la contraction
musculaire, la migration de vésicules le long des
microtubules, sont actuellement approchées par de
tels systèmes. L’intérêt considérable de ces outils
est qu’on peut, dans la mesure où ils ont été suffisamment simplifiés, les décomposer ensuite en
leurs éléments constitutifs et tester ceux-ci séparément dans des expériences de reconstitution ;p lusieurs d’entre eux seront décrits dans cet ouvrage.
2.8. Cytofluorimétrie en flux
et triage de cellules
Cette technique optique, appelée aussi cytométrie en flux continu, s’applique à des populations
de cellules isolées en suspension (organismes unicellulaires, cellules animales en culture, cellules
provenant d’un tissu mais dissociées enzymatiquement, protoplastes de cellules végétales…) et
permet de les analyser individuellement, de
manière automatique, par rapport à toute propriété pouvant impliquer une fluorescence. Le
principe consiste à marquer spécifiquement les cellules à sélectionner dans la population grâce à un
colorant fluorescent, qui peut être un anticorps
dirigé contre une protéine de surface (et auquel un
fluorochromeaété greffé), ou bien un composé se
fixant à l’ADN du noyau et responsable d’une
fluorescence (BET ou DAPI).
L’appareil utilisé comporte un système injectant, sous pression, la culture cellulaire ainsi traitée dans une buse très étroite, conçue de telle sorte
que les cellules défilent une à une devant une
petite fenêtre traversée par un fin faisceau laser de
longueur d’onde appropriée. La lumière réémise
par les cellules marquées est analysée et mesurée
par des photomultiplicateurs. Dans le cas d’un
marquage des noyaux, on peut identifier, dans une