3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
La GFP garde sa fluorescence in vivo quand elle
est fusionnée à une autre protéine, grâce aux techniques du génie génétique. Le gène qui la code
peut en effet être mis en phase à la suite d’un gène
de protéine d’intérêt X au sein d’une construction
(telle un plasmide) obtenue par manipulation de
l’ADN in vitro. Cette séquence codante, munie des
signaux appropriés, est introduite dans une cellule
au sein de laquelle elle s’exprime normalement en
produisant une protéine-chimère. Il est alors possible d’observer au microscope à fluorescence,
dans des cellules vivantes, la localisation de la protéine X-GFP ainsi synthétisée.
Cette technique permet donc de suivre, en temps
réel, le trafic intracellulaire d’une protéine et sa
dynamique (son adressage), ainsi que de nombreux
autres phénomènes biologiques : mouvements
d’organites, migrations cellulaires, déplacements
de virus. L’utilisation de la GFP tend actuellement
à remplacer, chaque fois que cela est possible, des
approches parfois anciennes et souvent très
lourdes, telles que : marquage radioactif et autoradiographie, cytoenzymologie ou immunocytochimie. Ces méthodes avaient aussi l’inconvénient de
nécessiter la fixation des cellules et n’autorisaient
pas des analyses in vivo.
On comprend donc bien tout l’intérêt de ce nouveau système de marquage (ou étiquetage) moléculaire, qui a ouvert une ère nouvelle en Biologie
Cellulaire et trouve également des applications en
Biologie Moléculaire, comme molécule «reporter ».
2.6. Analyse génétique des activités
cellulaires
Dans les premiers travaux de M ENDEL et de ses
successeurs, les mutants ont été employés pour
découvrir les lois de transmission des caractères
héréditaires et établir la théorie fondamentale dite
théorie chromosomique de l’hérédité. Pendant
près d’un demi-siècle, les mutations ont été utilisées comme de simples outils génétiques (marqueurs) permettant de différencier des souches.
C’est seulement à partir des années 1940 que l’on a
commencé à analyser la manière dont les gènes
gouvernent des réactions chimiques dans les cellules.
L’établissement de la relation directe existant
entre les gènes et les protéines (BEADLE et T ATUM :
«un gène-une enzyme ») a conduit à l’élucidation
de toutes les chaînes du métabolisme intermédiaire, aussi bien chez les Procaryotes que chez les
Eucaryotes (voir chapitre 4). La sélection de
mutants dits auxotrophes, présentant des exigences trophiques supplémentaires par rapport à
la souche sauvage, a été conduite chez divers organismes favorables à une analyse génétique. La
combinaison des études génétiques et physiologiques implique la possibilité de travailler sur les
deux phases (haploïde et diploïde) du cycle vital
des êtres eucaryotiques. Seuls quelques microorganismes exceptionnels ont été retenus par les
expérimentateurs ;i ls appartiennent aux groupes
des Champignons et des Algues : Neurospora,
Sordaria, Chlamydomonas et surtout la levure de
bière, ce dernier organisme étant actuellement
l’Eucaryote le plus connu au plan génétique.
La recherche s’est orientée vers la caractérisation de mutants conditionnels thermosensibles,
qui expriment leur phénotype particulier dans certaines conditions de température uniquement, et
présentent ainsi une souplesse d’utilisation remarquable. La possibilité de réaliser des tests dits de
complémentation fonctionnelle, en confrontant
au sein d’un même cytoplasme l’expression de
divers gènes mutés, deux à deux, constitue un
avantage considérable : le principe consiste à rassembler dans une cellule diploïde, par fusion cellulaire, les génomes de deux cellules haploïdes
mutantes. Si les génomes parentaux sont mutés au
niveau du même gène, aucun des deux n’apporte
à la cellule diploïde la capacité de réaliser la fonction normalement déterminée par ce gène. Si ces
génomes sont mutés respectivement sur deux gènes
différents concourant à l’expression de cette fonction, chacun des deux apportera dans la cellule
diploïde l’information qui manque à l’autre et cette
cellule réalisera la fonction qu’aucun des deux
parents haploïdes n’était capable d’assurer. Outre
le fait qu’il conduit à définir les caractéristiques de
dominance ou de récessivité des mutations isolées,
ce test permet de les classer rapidement en groupes
fonctionnels correspondant aux différentes étapes
des processus affectés.
L’analyse génétique constitue un outil incomparable pour disséquer des phénomènes qui peuvent
être d’une grande complexité. On peut citer trois
exemples classiques d’utilisation de tels mutants
de levure en biologie cellulaire.
•Le cycle cellulaire a été analysé dès la fin des
années 1970, grâce à une vaste collection de mutants
dont le développement était bloqué à des stades
différents du cycle. Leur caractérisation a abouti à
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
La GFP garde sa fluorescence in vivo quand elle
est fusionnée à une autre protéine, grâce aux techniques du génie génétique. Le gène qui la code
peut en effet être mis en phase à la suite d’un gène
de protéine d’intérêt X au sein d’une construction
(telle un plasmide) obtenue par manipulation de
l’ADN in vitro. Cette séquence codante, munie des
signaux appropriés, est introduite dans une cellule
au sein de laquelle elle s’exprime normalement en
produisant une protéine-chimère. Il est alors possible d’observer au microscope à fluorescence,
dans des cellules vivantes, la localisation de la protéine X-GFP ainsi synthétisée.
Cette technique permet donc de suivre, en temps
réel, le trafic intracellulaire d’une protéine et sa
dynamique (son adressage), ainsi que de nombreux
autres phénomènes biologiques : mouvements
d’organites, migrations cellulaires, déplacements
de virus. L’utilisation de la GFP tend actuellement
à remplacer, chaque fois que cela est possible, des
approches parfois anciennes et souvent très
lourdes, telles que : marquage radioactif et autoradiographie, cytoenzymologie ou immunocytochimie. Ces méthodes avaient aussi l’inconvénient de
nécessiter la fixation des cellules et n’autorisaient
pas des analyses in vivo.
On comprend donc bien tout l’intérêt de ce nouveau système de marquage (ou étiquetage) moléculaire, qui a ouvert une ère nouvelle en Biologie
Cellulaire et trouve également des applications en
Biologie Moléculaire, comme molécule «reporter ».
2.6. Analyse génétique des activités
cellulaires
Dans les premiers travaux de M ENDEL et de ses
successeurs, les mutants ont été employés pour
découvrir les lois de transmission des caractères
héréditaires et établir la théorie fondamentale dite
théorie chromosomique de l’hérédité. Pendant
près d’un demi-siècle, les mutations ont été utilisées comme de simples outils génétiques (marqueurs) permettant de différencier des souches.
C’est seulement à partir des années 1940 que l’on a
commencé à analyser la manière dont les gènes
gouvernent des réactions chimiques dans les cellules.
L’établissement de la relation directe existant
entre les gènes et les protéines (BEADLE et T ATUM :
«un gène-une enzyme ») a conduit à l’élucidation
de toutes les chaînes du métabolisme intermédiaire, aussi bien chez les Procaryotes que chez les
Eucaryotes (voir chapitre 4). La sélection de
mutants dits auxotrophes, présentant des exigences trophiques supplémentaires par rapport à
la souche sauvage, a été conduite chez divers organismes favorables à une analyse génétique. La
combinaison des études génétiques et physiologiques implique la possibilité de travailler sur les
deux phases (haploïde et diploïde) du cycle vital
des êtres eucaryotiques. Seuls quelques microorganismes exceptionnels ont été retenus par les
expérimentateurs ;i ls appartiennent aux groupes
des Champignons et des Algues : Neurospora,
Sordaria, Chlamydomonas et surtout la levure de
bière, ce dernier organisme étant actuellement
l’Eucaryote le plus connu au plan génétique.
La recherche s’est orientée vers la caractérisation de mutants conditionnels thermosensibles,
qui expriment leur phénotype particulier dans certaines conditions de température uniquement, et
présentent ainsi une souplesse d’utilisation remarquable. La possibilité de réaliser des tests dits de
complémentation fonctionnelle, en confrontant
au sein d’un même cytoplasme l’expression de
divers gènes mutés, deux à deux, constitue un
avantage considérable : le principe consiste à rassembler dans une cellule diploïde, par fusion cellulaire, les génomes de deux cellules haploïdes
mutantes. Si les génomes parentaux sont mutés au
niveau du même gène, aucun des deux n’apporte
à la cellule diploïde la capacité de réaliser la fonction normalement déterminée par ce gène. Si ces
génomes sont mutés respectivement sur deux gènes
différents concourant à l’expression de cette fonction, chacun des deux apportera dans la cellule
diploïde l’information qui manque à l’autre et cette
cellule réalisera la fonction qu’aucun des deux
parents haploïdes n’était capable d’assurer. Outre
le fait qu’il conduit à définir les caractéristiques de
dominance ou de récessivité des mutations isolées,
ce test permet de les classer rapidement en groupes
fonctionnels correspondant aux différentes étapes
des processus affectés.
L’analyse génétique constitue un outil incomparable pour disséquer des phénomènes qui peuvent
être d’une grande complexité. On peut citer trois
exemples classiques d’utilisation de tels mutants
de levure en biologie cellulaire.
•Le cycle cellulaire a été analysé dès la fin des
années 1970, grâce à une vaste collection de mutants
dont le développement était bloqué à des stades
différents du cycle. Leur caractérisation a abouti à