Figure 3.17
Mise en évidence des mitochondries grâce à des sondes fluorescentes d’activités physiologiques
(a) Fibroblaste coloré à la rhodamine 123 ; (b) Filaments de Champignon colorés au DASPMI (cliché D. Zickler, Orsay).
Noter le polymorphisme important des mitochondries.
68
B IOLOGIE CELLULAIRE
végétale comme test de viabilité des grains de pollen, par exemple. La grande vacuole centrale
typique des cellules végétales différenciées apparaît en «négatif » sur les images car la fluorescéine
ne peut y entrer.
•La rhodamine 123 ou le composé nommé
DASPMI pénètrent spécifiquement dans les mitochondries sous l’action du gradient de protons
transmembranaire qui caractérise cet organite (au
niveau de sa membrane interne). Accumulées dans
la matrice mitochondriale, ces substances fluorescent vivement et permettent une visualisation très
nette des organites (voir figure 3.17).
•L’ æquorine (protéine tirée d’une espèce de
méduse) fixe sélectivement les ions Ca
2+
, ce qui
induit sa luminescence. L’injection de cette protéine
dans une cellule permet donc de suivre d’éventuelles modifications de la concentration en ions
Ca
2+
libres dans le hyaloplasme, où ceux-ci se trouvent habituellement très dilués. Bien que délicate à
mettre en œuvre, cette technique de marquage a
permis l’analyse des processus de pénétration ou
de libération massive et transitoire de l’ion Ca
2+
à
partir de compartiments de stockage, lors du processus de fécondation, par exemple.
•De nombreux composés susceptibles de pénétrer spontanément dans les cellules, et capables de
lier spécifiquement (en devenant fluorescents) tous
les ions rencontrés dans les cellules, ont été mis au
point. Ils sont utilisés non seulement pour visualiser leur présence, mais aussi pour mesurer leur
concentration instantanée. Les plus connus sont la
chlorotétracycline et les composés nommés :
QUIN-2, indo-1 et fura-2, tous spécifiques de Ca
2+
;
la carboxyfluorescéine, qui fixe les H
+
, est un indicateur fluorescent du pH intracellulaire ;d ’autres
composés sont spécifiques des ions Na
+
et K
+
… On
comprend l’intérêt que présentent ces sondes,
quand on sait le rôle crucial des ions dans de nombreux processus de signalisation cellulaire et dans
la régulation des activités métaboliques (voir chapitre 13).
2.5. Utilisation de la GFP pour l’étude
de la localisation de protéines
dans des cellules vivantes
La GFP (green fluorescent protein) est une protéine provenant d’une espèce de méduse nommée
Aequorea victoria, chez qui elle provoque une bioluminescence naturelle. Elle présente deux pics
d’absorption de la lumière (dans l’ultra violet et
dans le bleu) et réémet dans le vert ; c’est le seul
exemple de protéine connue pour fluorescer intensément sans nécessiter de substrats additionnels.
Le gène codant cette petite protéine de 238 acides
aminés a été cloné en 1992 et, depuis lors, son utilisation en biologie cellulaire et moléculaire ne cesse
de se développer.
a
b
Mise en évidence des mitochondries grâce à des sondes fluorescentes d’activités physiologiques
(a) Fibroblaste coloré à la rhodamine 123 ; (b) Filaments de Champignon colorés au DASPMI (cliché D. Zickler, Orsay).
Noter le polymorphisme important des mitochondries.
68
B IOLOGIE CELLULAIRE
végétale comme test de viabilité des grains de pollen, par exemple. La grande vacuole centrale
typique des cellules végétales différenciées apparaît en «négatif » sur les images car la fluorescéine
ne peut y entrer.
•La rhodamine 123 ou le composé nommé
DASPMI pénètrent spécifiquement dans les mitochondries sous l’action du gradient de protons
transmembranaire qui caractérise cet organite (au
niveau de sa membrane interne). Accumulées dans
la matrice mitochondriale, ces substances fluorescent vivement et permettent une visualisation très
nette des organites (voir figure 3.17).
•L’ æquorine (protéine tirée d’une espèce de
méduse) fixe sélectivement les ions Ca
2+
, ce qui
induit sa luminescence. L’injection de cette protéine
dans une cellule permet donc de suivre d’éventuelles modifications de la concentration en ions
Ca
2+
libres dans le hyaloplasme, où ceux-ci se trouvent habituellement très dilués. Bien que délicate à
mettre en œuvre, cette technique de marquage a
permis l’analyse des processus de pénétration ou
de libération massive et transitoire de l’ion Ca
2+
à
partir de compartiments de stockage, lors du processus de fécondation, par exemple.
•De nombreux composés susceptibles de pénétrer spontanément dans les cellules, et capables de
lier spécifiquement (en devenant fluorescents) tous
les ions rencontrés dans les cellules, ont été mis au
point. Ils sont utilisés non seulement pour visualiser leur présence, mais aussi pour mesurer leur
concentration instantanée. Les plus connus sont la
chlorotétracycline et les composés nommés :
QUIN-2, indo-1 et fura-2, tous spécifiques de Ca
2+
;
la carboxyfluorescéine, qui fixe les H
+
, est un indicateur fluorescent du pH intracellulaire ;d ’autres
composés sont spécifiques des ions Na
+
et K
+
… On
comprend l’intérêt que présentent ces sondes,
quand on sait le rôle crucial des ions dans de nombreux processus de signalisation cellulaire et dans
la régulation des activités métaboliques (voir chapitre 13).
2.5. Utilisation de la GFP pour l’étude
de la localisation de protéines
dans des cellules vivantes
La GFP (green fluorescent protein) est une protéine provenant d’une espèce de méduse nommée
Aequorea victoria, chez qui elle provoque une bioluminescence naturelle. Elle présente deux pics
d’absorption de la lumière (dans l’ultra violet et
dans le bleu) et réémet dans le vert ; c’est le seul
exemple de protéine connue pour fluorescer intensément sans nécessiter de substrats additionnels.
Le gène codant cette petite protéine de 238 acides
aminés a été cloné en 1992 et, depuis lors, son utilisation en biologie cellulaire et moléculaire ne cesse
de se développer.
a
b