3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
67
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sés mis en jeu dans les réactions enzymatiques
(substrats et produits) sont d’une part incolores et
invisibles, et d’autre part hydrosolubles et diffusibles. Dans ces conditions, il semble évident que
le lieu d’action d’une enzyme sera bien difficile à
repérer avec précision dans une cellule ou une
coupe histologique. Les chimistes ont découvert
des molécules artificielles, mais pouvant être
reconnues comme des substrats spécifiques par les
enzymes, et ayant les propriétés suivantes :
–incolores au départ, elles deviennent colorées
après avoir été modifiées par l’enzyme, ou bien,
ayant une certaine couleur, elles en changent
après la réaction ;
–solubles au départ, elles deviennent insolubles
après la modification catalysée et précipitent sur
place, c’est-à-dire sur le lieu de la réaction.
Si ces conditions sont remplies, le produit de la
réaction s’accumule en abondance là où existe
l’enzyme, et conduit à un précipité coloré visible
en microscopie optique, ou opaque aux électrons
et détectable en microscopie électronique. De nombreuses hydrolases et enzymes d’oxydoréduction
ont ainsi pu être localisées à l’échelle des structures ou ultrastructures cellulaires.
2.4. Sondes fluorescentes
d’activités métaboliques
Divers composés de conception récente sont utilisés à l’heure actuelle pour visualiser des activités
enzymatiques ou des processus physiologiques
particuliers, in situ, au sein des cellules vivantes.
Leur simplicité de mise en œuvre et la diversité des
mécanismes étudiables sont telles que les techniques de cytoenzymologie traditionnelles ne sont
plus guère employées. Tous ces composés ont en
commun d’être à l’origine de phénomènes de luminescence ou de fluorescence, qui sont facilement
détectables avec des microscopes appropriés (plus
complexes que les microscopes classiques, car
nécessitant des systèmes de vidéo-amplification !).
On distingue trois types de situations :
–le composé artificiel employé fait l’objet d’une
modification chimique profonde qui entraîne
l’apparition de la propriété de fluorescence ;o n
parle de substrat fluorogénique, par opposition
aux substrats chromogéniques utilisés dans les
méthodes classiques ;
–le composé entre dans un organite où il rencontre
des conditions physicochimiques (pH) telles qu’il
devient fluorescent ;
–le composé fixe une autre molécule ou un ion
(caractéristiques d’un compartiment, dans lequel
il est entré, ou bien qui sont libérés à l’occasion
d’une activité cellulaire particulière) ;l e complexe, qui seul est fluorescent, est ensuite détecté.
Quelques exemples classiques peuvent être
donnés.
•Le diacétate de fluorescéine (composé hydrophobe) pénètre aisément dans les cellules vivantes
où il est décomposé en acétate et fluorescéine sous
l’action d’estérases variées ;ce dernier composé est
détectable grâce à sa fluorescence verte. La fluorescéine libérée dans le hyaloplasme ne peut plus
franchir de membrane lipoprotéique, car elle est
hydrophile. Cette propriété est utilisée en biologie
Figure 3.16
Cliché d’autoradiographie en microscopie électronique
Cette coupe montre la synthèse d’ADN dans deux
noyaux de spermatocytes de poisson. Les cellules ont été
incubées en présence de thymidine tritiée ; les «grains»
d’argent sont localisés au niveau de la chromatine.
Cliché J.-C. Clérot, Labo. BC4, Orsay.
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sés mis en jeu dans les réactions enzymatiques
(substrats et produits) sont d’une part incolores et
invisibles, et d’autre part hydrosolubles et diffusibles. Dans ces conditions, il semble évident que
le lieu d’action d’une enzyme sera bien difficile à
repérer avec précision dans une cellule ou une
coupe histologique. Les chimistes ont découvert
des molécules artificielles, mais pouvant être
reconnues comme des substrats spécifiques par les
enzymes, et ayant les propriétés suivantes :
–incolores au départ, elles deviennent colorées
après avoir été modifiées par l’enzyme, ou bien,
ayant une certaine couleur, elles en changent
après la réaction ;
–solubles au départ, elles deviennent insolubles
après la modification catalysée et précipitent sur
place, c’est-à-dire sur le lieu de la réaction.
Si ces conditions sont remplies, le produit de la
réaction s’accumule en abondance là où existe
l’enzyme, et conduit à un précipité coloré visible
en microscopie optique, ou opaque aux électrons
et détectable en microscopie électronique. De nombreuses hydrolases et enzymes d’oxydoréduction
ont ainsi pu être localisées à l’échelle des structures ou ultrastructures cellulaires.
2.4. Sondes fluorescentes
d’activités métaboliques
Divers composés de conception récente sont utilisés à l’heure actuelle pour visualiser des activités
enzymatiques ou des processus physiologiques
particuliers, in situ, au sein des cellules vivantes.
Leur simplicité de mise en œuvre et la diversité des
mécanismes étudiables sont telles que les techniques de cytoenzymologie traditionnelles ne sont
plus guère employées. Tous ces composés ont en
commun d’être à l’origine de phénomènes de luminescence ou de fluorescence, qui sont facilement
détectables avec des microscopes appropriés (plus
complexes que les microscopes classiques, car
nécessitant des systèmes de vidéo-amplification !).
On distingue trois types de situations :
–le composé artificiel employé fait l’objet d’une
modification chimique profonde qui entraîne
l’apparition de la propriété de fluorescence ;o n
parle de substrat fluorogénique, par opposition
aux substrats chromogéniques utilisés dans les
méthodes classiques ;
–le composé entre dans un organite où il rencontre
des conditions physicochimiques (pH) telles qu’il
devient fluorescent ;
–le composé fixe une autre molécule ou un ion
(caractéristiques d’un compartiment, dans lequel
il est entré, ou bien qui sont libérés à l’occasion
d’une activité cellulaire particulière) ;l e complexe, qui seul est fluorescent, est ensuite détecté.
Quelques exemples classiques peuvent être
donnés.
•Le diacétate de fluorescéine (composé hydrophobe) pénètre aisément dans les cellules vivantes
où il est décomposé en acétate et fluorescéine sous
l’action d’estérases variées ;ce dernier composé est
détectable grâce à sa fluorescence verte. La fluorescéine libérée dans le hyaloplasme ne peut plus
franchir de membrane lipoprotéique, car elle est
hydrophile. Cette propriété est utilisée en biologie
Figure 3.16
Cliché d’autoradiographie en microscopie électronique
Cette coupe montre la synthèse d’ADN dans deux
noyaux de spermatocytes de poisson. Les cellules ont été
incubées en présence de thymidine tritiée ; les «grains»
d’argent sont localisés au niveau de la chromatine.
Cliché J.-C. Clérot, Labo. BC4, Orsay.