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B IOLOGIE CELLULAIRE
particules (au-dessus de l’échantillon biologique
marqué, s’il s’agit de coupes). En autoradiographie
à haute résolution, pour la microscopie électronique, la technique de développement conditionne
la forme des grains d’argent développés qui matérialisent la radioactivité (grains punctiformes ou
en forme de tortillons ; voir figure 3.16).
2.3. Cytoenzymologie
C’est l’ensemble des techniques permettant de
localiser in situ des réactions enzymatiques spécifiques ;c ette approche, comme la cytochimie, a
connu son heure de gloire dans les années 60 et est
abandonnée de nos jours, au moins sous sa forme
initiale. Elle est cependant relayée par des
méthodes dérivées basées sur les mêmes principes,
qui seront donc brièvement rappelés ;e lle sera
illustrée par deux exemples (phosphatase et succinodéshydrogénase) traités sous forme d’encarts
dans les chapitres 7 et 10.
Dans la mesure où l’on visualise l’existence de
fonctions associées aux protéines, il est évident que
celles-ci doivent être actives dans le matériel utilisé. Or, la plupart des traitements histologiques
habituels (fixation, inclusion…) conduisent à
dénaturer et inactiver les protéines. Il faut donc
travailler sur du matériel vivant, avec toutes les
limitations évoquées à ce sujet dans le chapitre 2,
ou bien sur du matériel coupé ayant subi une fixation légère aux aldéhydes (non dénaturante) et une
inclusion douce (milieux d’inclusion hydrosolubles), ou enfin sur du matériel traité par congélation, dans lequel les protéines restent intactes
(techniques de cryofixation et cryotomie). Dans les
deux derniers cas, des protocoles existent pour la
microscopie photonique et la microscopie électronique. La méthode des coupes permet évidemment d’obtenir des localisations beaucoup plus
précises que lorsqu’on étudie des cellules entières.
La difficulté de la cytoenzymologie tient au fait
que c’est un mode de détection indirect de macromolécules catalytiques, par le biais des produits
des réactions catalysées. Or, la plupart des compoFigure 3.15
Principe de l’autoradiographie
La technique est ici appliquée à des coupes traitées pour la microscopie photonique.
Les cellules analysées ont incorporé, avant le traitement, un précurseur radioactif spécifique de l’ADN (thymidine tritiée), de sorte que seuls les noyaux apparaîtront marqués après développement de l’émulsion.
(1) Coupes de cellules marquées collées sur une lame de verre. (2) Coulage d’une émulsion photographique à l’obscurité. (3) Aspect des coupes de cellules après développement de l’émulsion.
(a), (b) et (c) : aspect en coupe des préparations 1 , 2 et 3 ; (d) : secteur agrandi de (c).
noyau
coupe de cellule
coupes de cellules
émulsion coulée sur les coupes
émulsion photographique
émulsion
développée
grains d’argent
grains
d’argent
atomes
radioactifs
trajet des électrons
lame
porte-objet
e – e –
e –
e – e –
e –
1
2
3
a
c
d
b
B IOLOGIE CELLULAIRE
particules (au-dessus de l’échantillon biologique
marqué, s’il s’agit de coupes). En autoradiographie
à haute résolution, pour la microscopie électronique, la technique de développement conditionne
la forme des grains d’argent développés qui matérialisent la radioactivité (grains punctiformes ou
en forme de tortillons ; voir figure 3.16).
2.3. Cytoenzymologie
C’est l’ensemble des techniques permettant de
localiser in situ des réactions enzymatiques spécifiques ;c ette approche, comme la cytochimie, a
connu son heure de gloire dans les années 60 et est
abandonnée de nos jours, au moins sous sa forme
initiale. Elle est cependant relayée par des
méthodes dérivées basées sur les mêmes principes,
qui seront donc brièvement rappelés ;e lle sera
illustrée par deux exemples (phosphatase et succinodéshydrogénase) traités sous forme d’encarts
dans les chapitres 7 et 10.
Dans la mesure où l’on visualise l’existence de
fonctions associées aux protéines, il est évident que
celles-ci doivent être actives dans le matériel utilisé. Or, la plupart des traitements histologiques
habituels (fixation, inclusion…) conduisent à
dénaturer et inactiver les protéines. Il faut donc
travailler sur du matériel vivant, avec toutes les
limitations évoquées à ce sujet dans le chapitre 2,
ou bien sur du matériel coupé ayant subi une fixation légère aux aldéhydes (non dénaturante) et une
inclusion douce (milieux d’inclusion hydrosolubles), ou enfin sur du matériel traité par congélation, dans lequel les protéines restent intactes
(techniques de cryofixation et cryotomie). Dans les
deux derniers cas, des protocoles existent pour la
microscopie photonique et la microscopie électronique. La méthode des coupes permet évidemment d’obtenir des localisations beaucoup plus
précises que lorsqu’on étudie des cellules entières.
La difficulté de la cytoenzymologie tient au fait
que c’est un mode de détection indirect de macromolécules catalytiques, par le biais des produits
des réactions catalysées. Or, la plupart des compoFigure 3.15
Principe de l’autoradiographie
La technique est ici appliquée à des coupes traitées pour la microscopie photonique.
Les cellules analysées ont incorporé, avant le traitement, un précurseur radioactif spécifique de l’ADN (thymidine tritiée), de sorte que seuls les noyaux apparaîtront marqués après développement de l’émulsion.
(1) Coupes de cellules marquées collées sur une lame de verre. (2) Coulage d’une émulsion photographique à l’obscurité. (3) Aspect des coupes de cellules après développement de l’émulsion.
(a), (b) et (c) : aspect en coupe des préparations 1 , 2 et 3 ; (d) : secteur agrandi de (c).
noyau
coupe de cellule
coupes de cellules
émulsion coulée sur les coupes
émulsion photographique
émulsion
développée
grains d’argent
grains
d’argent
atomes
radioactifs
trajet des électrons
lame
porte-objet
e – e –
e –
e – e –
e –
1
2
3
a
c
d
b