3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
65
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
avec A radioactif, le compartiment X restera très
peu de temps marqué ;le marquage sera ensuite
localisé dans Y, puis dans Z. La technique privilégiée pour suivre ce genre de transport est évidemment l’autoradiographie (voir plus loin).
En réalité, les cellules qui absorbent un composé le métabolisent tout en le faisant passer d’un
compartiment à un autre. Cela signifie que les
approches biochimiques et cytologiques sont
indissociables. Le succès d’une telle expérience,
c’est-à-dire la lisibilité du résultat, tient à la brièveté et à la netteté du pulse : il faut que les cellules
cessent d’incorporer brusquement la substance
radioactive. Ceci dépend en particulier de l’activité
spécifique du marqueur, qui doit être aussi élevée
que possible, et de la sensibilité des techniques de
détection. Le début de la chasse est marqué par
des lavages abondants des cellules pour éliminer
tout reste de radioactivité, adsorbée ou dans le
milieu. De plus, afin de diluer le marqueur qui
persiste inévitablement dans le cytoplasme de la
cellule, on fournit à celle-ci la même molécule, non
radioactive, en forte concentration dans le milieu.
L’entrée massive de ce composé conduit ainsi à un
ralentissement brutal de l’incorporation du marqueur au cours du métabolisme ;c et artifice permet d’assurer des pulses efficaces. Ces expériences
constituent un outil unique pour l’analyse du
métabolisme ainsi que celle de nombreux processus cellulaires.
2.2.4. D ÉTECTION DES MOLÉCULES MARQUÉES
Elle met en œuvre deux types principaux de
techniques : le comptage direct des particules
grâce à des compteurs appropriés et la technique
dite d’autoradiographie.
Les compteurs sont de deux types.
• Compteur de type Geiger : les particules
émises ionisent un gaz situé dans une enceinte
renfermant deux électrodes portées à un haut
potentiel ;l es électrons primaires sont accélérés et
provoquent de nouvelles ionisations en cascade,
de sorte qu’un bref courant est enregistré entre les
deux électrodes. Celui-ci est transformé en signal
sonore ou enregistré par un compteur d’impulsions. Cet appareil n’est plus guère utilisé car il ne
décèle que les rayonnements β
–
de très forte énergie.
• Compteur à scintillation : l’émission sert à
exciter une molécule «scintillante » qui réagit en
émettant des photons ;on fait alors une mesure de
lumière au moyen d’un photomultiplicateur qui
amplifie et transforme ce premier signal en courant électrique. Pratiquement, l’échantillon radioactif est mis dans une fiole remplie d’un solvant
contenant le produit scintillant ;p uisqu’il y a un
contact étroit entre l’isotope et le scintillant, même
les rayonnements β
–
les plus faibles sont détectables.
Cette dernière technique a permis l’extension
considérable de l’utilisation du tritium, qui est un
isotope peu coûteux et d’usage aisé. Le plus fréquemment, l’échantillon se présente sous forme
d’un filtre (ayant retenu un précipité, par exemple),
d’un fragment de chromatogramme, ou de tranche
de gel d’électrophorèse. Les résultats donnés par
les compteurs sont des cpm (coups par minute),
qu’il faut corriger pour tenir compte du rendement pour l’émission considérée ;c es valeurs sont
proportionnelles au nombre d’atomes radioactifs
contenus dans l’échantillon.
L’autoradiographie permet de localiser avec
précision une espèce moléculaire radioactive dans
un échantillon plan. Cette méthode est basée sur le
principe selon lequel les composés radioactifs
impressionnent les émulsions photographiques
vierges. Les particules β émises par le
3
H, le
14
C ou
le
32
P réduisent les grains de bromure d’argent
contenus dans l’émulsion en argent métallique, à
la manière de la lumière. Dans un premier temps,
il y a formation d’une image latente au niveau des
cristaux d’AgBr atteints par le rayonnement ;l eur
réduction est achevée par un révélateur, qui
conduit à la formation de grains d’argent visibles.
Le fixateur élimine enfin tous les cristaux d’AgBr
n’intervenant pas (voir figure 3.15).
L’autoradiographie appliquée à des coupes histologiques ou des écrasements de cellules est une
technique de biologie cellulaire ;e lle est aussi très
utilisée en biochimie ou en biologie moléculaire, et
s’applique alors à des plaques de chromatographie
ou des gels d’électrophorèse. Dans le cas des
coupes, l’émulsion est directement coulée sur
l’échantillon collé sur la lame de verre ;s ’il s’agit
de plaques ou de gels, un film rigide (de type
radiographie médicale) est étroitement appliqué
contre eux. Après un temps d’exposition variable
(de quelques minutes à quelques jours), en fonction de la quantité de radioactivité et de la nature
de l’isotope utilisé, le film sensible est révélé et
traité comme une épreuve photographique. On
observe, dans l’émulsion, une accumulation de
grains d’argent à l’endroit précis de l’émission des
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
avec A radioactif, le compartiment X restera très
peu de temps marqué ;le marquage sera ensuite
localisé dans Y, puis dans Z. La technique privilégiée pour suivre ce genre de transport est évidemment l’autoradiographie (voir plus loin).
En réalité, les cellules qui absorbent un composé le métabolisent tout en le faisant passer d’un
compartiment à un autre. Cela signifie que les
approches biochimiques et cytologiques sont
indissociables. Le succès d’une telle expérience,
c’est-à-dire la lisibilité du résultat, tient à la brièveté et à la netteté du pulse : il faut que les cellules
cessent d’incorporer brusquement la substance
radioactive. Ceci dépend en particulier de l’activité
spécifique du marqueur, qui doit être aussi élevée
que possible, et de la sensibilité des techniques de
détection. Le début de la chasse est marqué par
des lavages abondants des cellules pour éliminer
tout reste de radioactivité, adsorbée ou dans le
milieu. De plus, afin de diluer le marqueur qui
persiste inévitablement dans le cytoplasme de la
cellule, on fournit à celle-ci la même molécule, non
radioactive, en forte concentration dans le milieu.
L’entrée massive de ce composé conduit ainsi à un
ralentissement brutal de l’incorporation du marqueur au cours du métabolisme ;c et artifice permet d’assurer des pulses efficaces. Ces expériences
constituent un outil unique pour l’analyse du
métabolisme ainsi que celle de nombreux processus cellulaires.
2.2.4. D ÉTECTION DES MOLÉCULES MARQUÉES
Elle met en œuvre deux types principaux de
techniques : le comptage direct des particules
grâce à des compteurs appropriés et la technique
dite d’autoradiographie.
Les compteurs sont de deux types.
• Compteur de type Geiger : les particules
émises ionisent un gaz situé dans une enceinte
renfermant deux électrodes portées à un haut
potentiel ;l es électrons primaires sont accélérés et
provoquent de nouvelles ionisations en cascade,
de sorte qu’un bref courant est enregistré entre les
deux électrodes. Celui-ci est transformé en signal
sonore ou enregistré par un compteur d’impulsions. Cet appareil n’est plus guère utilisé car il ne
décèle que les rayonnements β
–
de très forte énergie.
• Compteur à scintillation : l’émission sert à
exciter une molécule «scintillante » qui réagit en
émettant des photons ;on fait alors une mesure de
lumière au moyen d’un photomultiplicateur qui
amplifie et transforme ce premier signal en courant électrique. Pratiquement, l’échantillon radioactif est mis dans une fiole remplie d’un solvant
contenant le produit scintillant ;p uisqu’il y a un
contact étroit entre l’isotope et le scintillant, même
les rayonnements β
–
les plus faibles sont détectables.
Cette dernière technique a permis l’extension
considérable de l’utilisation du tritium, qui est un
isotope peu coûteux et d’usage aisé. Le plus fréquemment, l’échantillon se présente sous forme
d’un filtre (ayant retenu un précipité, par exemple),
d’un fragment de chromatogramme, ou de tranche
de gel d’électrophorèse. Les résultats donnés par
les compteurs sont des cpm (coups par minute),
qu’il faut corriger pour tenir compte du rendement pour l’émission considérée ;c es valeurs sont
proportionnelles au nombre d’atomes radioactifs
contenus dans l’échantillon.
L’autoradiographie permet de localiser avec
précision une espèce moléculaire radioactive dans
un échantillon plan. Cette méthode est basée sur le
principe selon lequel les composés radioactifs
impressionnent les émulsions photographiques
vierges. Les particules β émises par le
3
H, le
14
C ou
le
32
P réduisent les grains de bromure d’argent
contenus dans l’émulsion en argent métallique, à
la manière de la lumière. Dans un premier temps,
il y a formation d’une image latente au niveau des
cristaux d’AgBr atteints par le rayonnement ;l eur
réduction est achevée par un révélateur, qui
conduit à la formation de grains d’argent visibles.
Le fixateur élimine enfin tous les cristaux d’AgBr
n’intervenant pas (voir figure 3.15).
L’autoradiographie appliquée à des coupes histologiques ou des écrasements de cellules est une
technique de biologie cellulaire ;e lle est aussi très
utilisée en biochimie ou en biologie moléculaire, et
s’applique alors à des plaques de chromatographie
ou des gels d’électrophorèse. Dans le cas des
coupes, l’émulsion est directement coulée sur
l’échantillon collé sur la lame de verre ;s ’il s’agit
de plaques ou de gels, un film rigide (de type
radiographie médicale) est étroitement appliqué
contre eux. Après un temps d’exposition variable
(de quelques minutes à quelques jours), en fonction de la quantité de radioactivité et de la nature
de l’isotope utilisé, le film sensible est révélé et
traité comme une épreuve photographique. On
observe, dans l’émulsion, une accumulation de
grains d’argent à l’endroit précis de l’émission des