•A nalyse des échanges, transports et accumulations, en général sans transformation, des ions ou
molécules marquées. Ceux-ci s’étudient au niveau
de l’organisme entier ou de la cellule ;p ar
exemple : 1) étude de la circulation sanguine, de
l’excrétion urinaire ;accumulation du
32
P au niveau
des tumeurs, de
131
I au niveau de la thyroïde…, 2)
étude des échanges de Na
+
et K
+
…, à travers la
membrane plasmique, 3) étude des transports
intracellulaires au cours des processus sécrétoires
ou des transferts d’information d’un compartiment à un autre.
•Analyse des transformations biochimiques. Si
l’analyse chimique permet d’établir un catalogue
précis des constituants cellulaires (concentrations,
répartitions), elle ne donne qu’une vision statique
des phénomènes biologiques. Grâce aux précurseurs marqués, il est possible d’étudier les interconversions et les filiations des métabolites ;p ar
exemple, si l’on donne un tel précurseur à des cellules, on retrouvera plus tard de nombreux métabolites marqués, nécessairement issus de celui-ci
(expériences de pulse-chase ; voir plus loin).
On trouve dans le commerce un grand nombre
de molécules marquées de façon précise. Celles-ci
sont ajoutées au milieu de culture mais, dans le cas
de difficultés de pénétration, on peut les injecter
directement dans les cellules (ce qui permet
d’ailleurs de mieux contrôler les quantités d’isotopes absorbées). La micro-injection, longtemps
réservée aux cellules géantes (ovocytes
d’Amphibiens, par exemple) se pratique actuellement dans tous les types de cellules en culture. Il
suffit en général de fournir les radio-isotopes à
l’état de traces et pendant des temps très courts
(appelés pulses), car les méthodes de détection sont
très sensibles ;d e plus, il ne faut pas oublier la
toxicité des isotopes à forte dose à cause des phénomènes d’ionisation de la matière vivante. On les
donne en fait aux cellules sous forme de sels (Na
+
,
K
+
, Ca
2+
), de molécules minérales simples (CO 2 ) ou
organiques (précurseurs de macromolécules :
sucres, bases ou acides aminés).
2.2.3. P RINCIPE ET INTÉRÊT
DES EXPÉRIENCES DE PULSE- CHASE
Comme leur nom l’indique, ces expériences
sont conduites en deux temps.
•Le pulse : des cellules vivantes sont soumises,
dans un milieu de survie approprié, à un traitement de courte durée destiné à marquer spécifiquement certaines de leurs molécules. On fournit
donc aux cellules un composé assimilable fortement radiomarqué servant de précurseur métabolique. Un acide aminé radioactif, par exemple,
s’incorporera dans les protéines qui seront alors
marquées. La durée du pulse doit être brève, comparée à celle des phénomènes que l’on étudie (de
quelques secondes à quelques heures).
•La chasse ( chase) est une période de «poursuite » des seules molécules marquées lors du pulse.
Après le marquage, les cellules vivantes sont
conservées pendant un certain temps dans le même
milieu de survie dépourvu du précurseur marqué,
ce qui nécessite auparavant de nombreux lavages.
Au cours de cette période, le métabolisme cellulaire
suit son cours normal et les molécules marquées
sont engagées dans les processus de transport
et/ou les transformations chimiques habituels.
L’intérêt évident de cette opération est que, si
l’on est capable de repérer aisément les molécules
marquées (ou leurs dérivés) dans des extraits ou
des fractions purifiées par fractionnement cellulaire, ou bien dans des structures précises, on
pourra suivre l’évolution des processus biochimiques et biologiques sur des échantillons de la
population de départ prélevés au cours du temps.
Ces expériences permettent d’aborder deux
sortes de problèmes en biologie, qui peuvent être
indépendants, mais qui se superposent le plus
souvent :
–soit un composé A qui, dans la cellule, est normalement transformé en B, puis en C, puis en
D…, le long d’une chaîne de réactions (on ne se
préoccupe pas ici des compartiments où ces réactions ont lieu). Il suffit de fournir le composé A
radioactif aux cellules ;s’il pénètre, il sera pris en
charge par les processus qui donneront B, puis C,
puis D…, et ces composés deviendront successivement radioactifs. Après la période de pulse, les
cellules à qui on ne fournit plus A radioactif utilisent à nouveau du A non radioactif (endogène
ou exogène) pour fabriquer B, C et D. Au cours
du temps, on a donc une vague de synthèse de
produits radioactifs qu’on peut identifier par les
techniques de la biochimie, et qui indiqueront
exactement l’ordre des réactions ;
–soit un composé A qui entre dans la cellule et se
trouve au départ dans un compartiment X. Peu
après, sans transformation, il passe dans un compartiment Y, puis dans Z… Il ne s’agit plus ici de
modifications biochimiques mais de simple
transport dans la cellule. Si on fait un pulse bref
64
B IOLOGIE CELLULAIRE
molécules marquées. Ceux-ci s’étudient au niveau
de l’organisme entier ou de la cellule ;p ar
exemple : 1) étude de la circulation sanguine, de
l’excrétion urinaire ;accumulation du
32
P au niveau
des tumeurs, de
131
I au niveau de la thyroïde…, 2)
étude des échanges de Na
+
et K
+
…, à travers la
membrane plasmique, 3) étude des transports
intracellulaires au cours des processus sécrétoires
ou des transferts d’information d’un compartiment à un autre.
•Analyse des transformations biochimiques. Si
l’analyse chimique permet d’établir un catalogue
précis des constituants cellulaires (concentrations,
répartitions), elle ne donne qu’une vision statique
des phénomènes biologiques. Grâce aux précurseurs marqués, il est possible d’étudier les interconversions et les filiations des métabolites ;p ar
exemple, si l’on donne un tel précurseur à des cellules, on retrouvera plus tard de nombreux métabolites marqués, nécessairement issus de celui-ci
(expériences de pulse-chase ; voir plus loin).
On trouve dans le commerce un grand nombre
de molécules marquées de façon précise. Celles-ci
sont ajoutées au milieu de culture mais, dans le cas
de difficultés de pénétration, on peut les injecter
directement dans les cellules (ce qui permet
d’ailleurs de mieux contrôler les quantités d’isotopes absorbées). La micro-injection, longtemps
réservée aux cellules géantes (ovocytes
d’Amphibiens, par exemple) se pratique actuellement dans tous les types de cellules en culture. Il
suffit en général de fournir les radio-isotopes à
l’état de traces et pendant des temps très courts
(appelés pulses), car les méthodes de détection sont
très sensibles ;d e plus, il ne faut pas oublier la
toxicité des isotopes à forte dose à cause des phénomènes d’ionisation de la matière vivante. On les
donne en fait aux cellules sous forme de sels (Na
+
,
K
+
, Ca
2+
), de molécules minérales simples (CO 2 ) ou
organiques (précurseurs de macromolécules :
sucres, bases ou acides aminés).
2.2.3. P RINCIPE ET INTÉRÊT
DES EXPÉRIENCES DE PULSE- CHASE
Comme leur nom l’indique, ces expériences
sont conduites en deux temps.
•Le pulse : des cellules vivantes sont soumises,
dans un milieu de survie approprié, à un traitement de courte durée destiné à marquer spécifiquement certaines de leurs molécules. On fournit
donc aux cellules un composé assimilable fortement radiomarqué servant de précurseur métabolique. Un acide aminé radioactif, par exemple,
s’incorporera dans les protéines qui seront alors
marquées. La durée du pulse doit être brève, comparée à celle des phénomènes que l’on étudie (de
quelques secondes à quelques heures).
•La chasse ( chase) est une période de «poursuite » des seules molécules marquées lors du pulse.
Après le marquage, les cellules vivantes sont
conservées pendant un certain temps dans le même
milieu de survie dépourvu du précurseur marqué,
ce qui nécessite auparavant de nombreux lavages.
Au cours de cette période, le métabolisme cellulaire
suit son cours normal et les molécules marquées
sont engagées dans les processus de transport
et/ou les transformations chimiques habituels.
L’intérêt évident de cette opération est que, si
l’on est capable de repérer aisément les molécules
marquées (ou leurs dérivés) dans des extraits ou
des fractions purifiées par fractionnement cellulaire, ou bien dans des structures précises, on
pourra suivre l’évolution des processus biochimiques et biologiques sur des échantillons de la
population de départ prélevés au cours du temps.
Ces expériences permettent d’aborder deux
sortes de problèmes en biologie, qui peuvent être
indépendants, mais qui se superposent le plus
souvent :
–soit un composé A qui, dans la cellule, est normalement transformé en B, puis en C, puis en
D…, le long d’une chaîne de réactions (on ne se
préoccupe pas ici des compartiments où ces réactions ont lieu). Il suffit de fournir le composé A
radioactif aux cellules ;s’il pénètre, il sera pris en
charge par les processus qui donneront B, puis C,
puis D…, et ces composés deviendront successivement radioactifs. Après la période de pulse, les
cellules à qui on ne fournit plus A radioactif utilisent à nouveau du A non radioactif (endogène
ou exogène) pour fabriquer B, C et D. Au cours
du temps, on a donc une vague de synthèse de
produits radioactifs qu’on peut identifier par les
techniques de la biochimie, et qui indiqueront
exactement l’ordre des réactions ;
–soit un composé A qui entre dans la cellule et se
trouve au départ dans un compartiment X. Peu
après, sans transformation, il passe dans un compartiment Y, puis dans Z… Il ne s’agit plus ici de
modifications biochimiques mais de simple
transport dans la cellule. Si on fait un pulse bref
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B IOLOGIE CELLULAIRE