3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
63
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
2.2. Expériences de marquage radioactif
in vivo
2.2.1. R APPELS SUR LES ISOTOPES
Les différents éléments rencontrés dans la nature
ne sont pas des populations homogènes d’atomes ;
ce sont des mélanges d’isotopes (atomes ayant un
même nombre d’électrons mais un noyau de
masse différente). À côté des éléments les plus
courants :
1
H,
12
C,
14
N,
16
O…, on distingue les isotopes rares stables :
2
H,
13
C,
15
N,
18
O…, et les radioisotopes :
3
H,
14
C… Les noyaux de ces derniers
présentent un rapport protons/neutrons déséquilibré, et des redistributions spontanées de particules se produisent de façon qu’un état plus stable
soit trouvé. Ceci s’accompagne d’émissions de
particules chargées ou de radiations : on parle de
désintégration du noyau, c’est le phénomène de
radioactivité.
La radioactivité des atomes constituant la
matière vivante est due essentiellement à l’émission
d’électrons négatifs (particules β
–
). Ceux-ci possèdent une énergie cinétique variant de façon continue et comprise entre deux valeurs extrêmes
spécifiques de l’élément qui se désintègre. Chaque
radio-isotope est caractérisé par trois paramètres :
1) le type d’émission, 2) la période ou demi-vie,
temps nécessaire pour que la moitié des atomes
radioactifs se désintègre, et 3) l’énergie moyenne
de l’émission (exprimée en Méga Électrons Volts, ou
MEV). L’activité spécifique d’un échantillon radioactif est définie par le rapport : désintégrations par
minute (dpm)/masse de l’échantillon exprimée en
grammes ou moles. L’unité de radioactivité est le
becquerel, qui correspond à une transformation
nucléaire (désintégration) par seconde.
Les principaux radio-isotopes employés en biologie ou physiologie cellulaire sont :
3
H -
14
C -
32
P -
35
S -
22
Na -
42
K -
125
I. On les utilise sous forme de
molécules minérales ou organiques dans lesquelles un ou plusieurs atomes sont radioactifs ;
celles-ci ne sont pas chimiquement distinguées des
autres par les cellules et sont parfaitement assimilées (absorbées, métabolisées et incorporées dans
leur propre matière). Si l’on a les moyens de déceler la présence de l’isotope, on pourra suivre son
cheminement dans la cellule ou l’organisme ;l a
molécule agit donc comme un «espion ». Ceci
implique évidemment que l’on puisse :
–soit suivre la molécule-traceur dans l’organisme
sans avoir à le détruire : isotopes à émissions très
pénétrantes faciles à déceler de l’extérieur ;
–soit localiser l’isotope sur des préparations histologiques (voir plus loin la technique d’autoradiographie) ;
–soit fractionner la cellule en espèces moléculaires
pures ou en classes d’organites purs.
Les isotopes naturels lourds, comme le
15
N ou le
13
C, ont été employés en biologie moléculaire
(expériences classiques de M ESELSON et S TAHL relatives à la réplication semi-conservative de l’ADN,
en 1958) ;l eur utilisation nécessite la technique de
l’ultracentrifugation en gradient de densité de
CsCl, qui est relativement lourde et de moins en
moins employée. Ces isotopes présentent par contre
un intérêt considérable pour l’étude des grands
cycles des éléments au sein de la biosphère. Ils
constituent en effet des traceurs naturels et enregistrent l’origine et l’histoire des molécules organiques présentes dans les cellules des Végétaux ou
des Animaux, à travers leur composition isotopique. La biogéochimie isotopique décrit la dynamique actuelle des éléments mais elle reconstitue
aussi les paléo-environnements. Son outil principal
est le spectromètre de masse, qui sépare les différents isotopes les uns des autres et les quantifie.
2.2.2. U TILISATION DES PRÉCURSEURS MARQUÉS PAR
DES RADIO- ISOTOPES
Les principales utilisations se classent schématiquement en deux rubriques.
Figure 3.14
Cellules végétales en culture : cal de cellules de bananier
(Cliché Labo MVE, Orsay).
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
2.2. Expériences de marquage radioactif
in vivo
2.2.1. R APPELS SUR LES ISOTOPES
Les différents éléments rencontrés dans la nature
ne sont pas des populations homogènes d’atomes ;
ce sont des mélanges d’isotopes (atomes ayant un
même nombre d’électrons mais un noyau de
masse différente). À côté des éléments les plus
courants :
1
H,
12
C,
14
N,
16
O…, on distingue les isotopes rares stables :
2
H,
13
C,
15
N,
18
O…, et les radioisotopes :
3
H,
14
C… Les noyaux de ces derniers
présentent un rapport protons/neutrons déséquilibré, et des redistributions spontanées de particules se produisent de façon qu’un état plus stable
soit trouvé. Ceci s’accompagne d’émissions de
particules chargées ou de radiations : on parle de
désintégration du noyau, c’est le phénomène de
radioactivité.
La radioactivité des atomes constituant la
matière vivante est due essentiellement à l’émission
d’électrons négatifs (particules β
–
). Ceux-ci possèdent une énergie cinétique variant de façon continue et comprise entre deux valeurs extrêmes
spécifiques de l’élément qui se désintègre. Chaque
radio-isotope est caractérisé par trois paramètres :
1) le type d’émission, 2) la période ou demi-vie,
temps nécessaire pour que la moitié des atomes
radioactifs se désintègre, et 3) l’énergie moyenne
de l’émission (exprimée en Méga Électrons Volts, ou
MEV). L’activité spécifique d’un échantillon radioactif est définie par le rapport : désintégrations par
minute (dpm)/masse de l’échantillon exprimée en
grammes ou moles. L’unité de radioactivité est le
becquerel, qui correspond à une transformation
nucléaire (désintégration) par seconde.
Les principaux radio-isotopes employés en biologie ou physiologie cellulaire sont :
3
H -
14
C -
32
P -
35
S -
22
Na -
42
K -
125
I. On les utilise sous forme de
molécules minérales ou organiques dans lesquelles un ou plusieurs atomes sont radioactifs ;
celles-ci ne sont pas chimiquement distinguées des
autres par les cellules et sont parfaitement assimilées (absorbées, métabolisées et incorporées dans
leur propre matière). Si l’on a les moyens de déceler la présence de l’isotope, on pourra suivre son
cheminement dans la cellule ou l’organisme ;l a
molécule agit donc comme un «espion ». Ceci
implique évidemment que l’on puisse :
–soit suivre la molécule-traceur dans l’organisme
sans avoir à le détruire : isotopes à émissions très
pénétrantes faciles à déceler de l’extérieur ;
–soit localiser l’isotope sur des préparations histologiques (voir plus loin la technique d’autoradiographie) ;
–soit fractionner la cellule en espèces moléculaires
pures ou en classes d’organites purs.
Les isotopes naturels lourds, comme le
15
N ou le
13
C, ont été employés en biologie moléculaire
(expériences classiques de M ESELSON et S TAHL relatives à la réplication semi-conservative de l’ADN,
en 1958) ;l eur utilisation nécessite la technique de
l’ultracentrifugation en gradient de densité de
CsCl, qui est relativement lourde et de moins en
moins employée. Ces isotopes présentent par contre
un intérêt considérable pour l’étude des grands
cycles des éléments au sein de la biosphère. Ils
constituent en effet des traceurs naturels et enregistrent l’origine et l’histoire des molécules organiques présentes dans les cellules des Végétaux ou
des Animaux, à travers leur composition isotopique. La biogéochimie isotopique décrit la dynamique actuelle des éléments mais elle reconstitue
aussi les paléo-environnements. Son outil principal
est le spectromètre de masse, qui sépare les différents isotopes les uns des autres et les quantifie.
2.2.2. U TILISATION DES PRÉCURSEURS MARQUÉS PAR
DES RADIO- ISOTOPES
Les principales utilisations se classent schématiquement en deux rubriques.
Figure 3.14
Cellules végétales en culture : cal de cellules de bananier
(Cliché Labo MVE, Orsay).