3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
1.4.3. P ROBLÈMES RENCONTRÉS AU COURS DU FRACTIONNEMENT CELLULAIRE
La mise en œuvre de ces expériences présente
quelques difficultés et les résultats obtenus doivent
être contrôlés et confirmés par des approches
convergentes. La méthode décrite est très efficace
pour des organites compacts, globulaires ou vésiculaires : noyaux, chloroplastes, mitochondries…
En revanche, des structures membranaires dont la
géométrie est complexe, telles que le réticulum
endoplasmique ou l’appareil de G OLGI, sont évidemment difficiles à isoler dans de bonnes conditions. De fait, toutes ces membranes sont déchirées
lors de l’homogénéisation et leurs lambeaux se
referment spontanément sur eux-mêmes pour
donner de minuscules vésicules nommées microsomes. Ces derniers sont récupérés par centrifugation d’un surnageant post-mitochondrial et
séparés en plusieurs catégories (microsomes lisses
et rugueux) sur gradient de saccharose (voir chapitre9).
Après de nombreux tâtonnements, on a cependant pu isoler des structures «sophistiquées»
comme des bordures en brosse d’entérocytes, des
dictyosomes golgiens, des infraciliatures de cellules ciliées… Par ailleurs, certains organites sédimentent à des vitesses tellement voisines qu’ils
sont très difficiles à séparer en une seule
opération : c’est le cas des mitochondries, des lysosomes et des peroxysomes, dont l’identité enzymatique n’a pas été aisée à établir. Il faut alors
combiner judicieusement les centrifugations différentielles et en gradient de saccharose.
Les organites isolés par ces techniques doivent
au minimum conserver l’aspect et la taille vus sur le
vivant, toute modification de structure relevant
vraisemblablement de l’artefact. Ceci justifie des
contrôles cytologiques constants au cours de la
mise au point d’un protocole particulier de fractionnement cellulaire. Mais à côté des artefacts de
type structural, il en existe d’ordre physiologique,
qui sont plus difficiles à déceler : tout organite
séparé de son contexte modifie presque inévitablement son métabolisme. Très souvent aussi, des
organites endommagés au cours de l’homogénéisation perdent des enzymes qui peuvent aller
s’adsorber sur d’autres, les «contaminer» et ainsi
modifier leurs propriétés.
Lorsqu’une fraction est obtenue, son degré de
pureté doit être vérifié ;ce contrôle est cytologique
ou physiologique. En raison de la taille des structures analysées, la microscopie électronique est
souvent la seule méthode fiable. Quand la connaissance du type cellulaire est assez poussée, des
contrôles biochimiques sont possibles ;c ertains
organites sont en effet caractérisés par des activités
enzymatiques spécifiques, qui servent de marqueurs d’identité. Ainsi, la succinodéshydrogénase est un marqueur des mitochondries, comme
diverses glycosidases sont des marqueurs des saccules golgiens, ou certaines phosphatases acides,
des lysosomes. On peut alors estimer le degré de
contamination d’une fraction par un simple dosage
(voir chapitre 7).
1.5. Observation directe des macromolécules
et des édifices supramoléculaires
Elle est possible grâce à la mise en œuvre de
deux techniques : la coloration négative et
l’ombrage métallique, qui s’appliquent à des
objets de petites dimensions et de forme relativement simple, tels que des éléments cellulaires isolés : organites, fragments d’organites, Virus ou
bien molécules. La première permet de voir, en
microscopie électronique à transmission, de très
fins détails que les coupes ne parviennent pas à
visualiser, en particulier dans le cas des structures
fibreuses (flagelles bactériens, microtubules, molécules de collagène…). Le principe de l’ombrage
métallique est un peu différent et les images obtenues sont sensiblement plus empâtées que dans le
cas précédent. Il permet, en particulier, de visualiser simplement les molécules d’acides nucléiques ;
il constitue également une étape dans le protocole
de cryofracture (voir chapitre 5). La microscopie
dite à effet tunnel constitue la dernière née de ces
techniques de visualisation de molécules, mais ses
applications en biologie restent encore modestes.
1.5.1. C OLORATION NÉGATIVE
Le principe de la méthode est simple. Les particules à observer sont mises en suspension dans un
composé, ou «colorant », en solution aqueuse, et
ayant les propriétés suivantes : 1) grande solubilité, afin d’obtenir une concentration élevée, 2)
opacité aux électrons une fois l’eau évaporée, 3)
absence de formation de cristaux au séchage
(structure amorphe), et 4) stabilité au bombardement électronique.
On utilise en général l’acide phosphotungstique
dissous dans l’eau ;les particules suspendues dans
cette solution sont déposées sur des grilles de
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
1.4.3. P ROBLÈMES RENCONTRÉS AU COURS DU FRACTIONNEMENT CELLULAIRE
La mise en œuvre de ces expériences présente
quelques difficultés et les résultats obtenus doivent
être contrôlés et confirmés par des approches
convergentes. La méthode décrite est très efficace
pour des organites compacts, globulaires ou vésiculaires : noyaux, chloroplastes, mitochondries…
En revanche, des structures membranaires dont la
géométrie est complexe, telles que le réticulum
endoplasmique ou l’appareil de G OLGI, sont évidemment difficiles à isoler dans de bonnes conditions. De fait, toutes ces membranes sont déchirées
lors de l’homogénéisation et leurs lambeaux se
referment spontanément sur eux-mêmes pour
donner de minuscules vésicules nommées microsomes. Ces derniers sont récupérés par centrifugation d’un surnageant post-mitochondrial et
séparés en plusieurs catégories (microsomes lisses
et rugueux) sur gradient de saccharose (voir chapitre9).
Après de nombreux tâtonnements, on a cependant pu isoler des structures «sophistiquées»
comme des bordures en brosse d’entérocytes, des
dictyosomes golgiens, des infraciliatures de cellules ciliées… Par ailleurs, certains organites sédimentent à des vitesses tellement voisines qu’ils
sont très difficiles à séparer en une seule
opération : c’est le cas des mitochondries, des lysosomes et des peroxysomes, dont l’identité enzymatique n’a pas été aisée à établir. Il faut alors
combiner judicieusement les centrifugations différentielles et en gradient de saccharose.
Les organites isolés par ces techniques doivent
au minimum conserver l’aspect et la taille vus sur le
vivant, toute modification de structure relevant
vraisemblablement de l’artefact. Ceci justifie des
contrôles cytologiques constants au cours de la
mise au point d’un protocole particulier de fractionnement cellulaire. Mais à côté des artefacts de
type structural, il en existe d’ordre physiologique,
qui sont plus difficiles à déceler : tout organite
séparé de son contexte modifie presque inévitablement son métabolisme. Très souvent aussi, des
organites endommagés au cours de l’homogénéisation perdent des enzymes qui peuvent aller
s’adsorber sur d’autres, les «contaminer» et ainsi
modifier leurs propriétés.
Lorsqu’une fraction est obtenue, son degré de
pureté doit être vérifié ;ce contrôle est cytologique
ou physiologique. En raison de la taille des structures analysées, la microscopie électronique est
souvent la seule méthode fiable. Quand la connaissance du type cellulaire est assez poussée, des
contrôles biochimiques sont possibles ;c ertains
organites sont en effet caractérisés par des activités
enzymatiques spécifiques, qui servent de marqueurs d’identité. Ainsi, la succinodéshydrogénase est un marqueur des mitochondries, comme
diverses glycosidases sont des marqueurs des saccules golgiens, ou certaines phosphatases acides,
des lysosomes. On peut alors estimer le degré de
contamination d’une fraction par un simple dosage
(voir chapitre 7).
1.5. Observation directe des macromolécules
et des édifices supramoléculaires
Elle est possible grâce à la mise en œuvre de
deux techniques : la coloration négative et
l’ombrage métallique, qui s’appliquent à des
objets de petites dimensions et de forme relativement simple, tels que des éléments cellulaires isolés : organites, fragments d’organites, Virus ou
bien molécules. La première permet de voir, en
microscopie électronique à transmission, de très
fins détails que les coupes ne parviennent pas à
visualiser, en particulier dans le cas des structures
fibreuses (flagelles bactériens, microtubules, molécules de collagène…). Le principe de l’ombrage
métallique est un peu différent et les images obtenues sont sensiblement plus empâtées que dans le
cas précédent. Il permet, en particulier, de visualiser simplement les molécules d’acides nucléiques ;
il constitue également une étape dans le protocole
de cryofracture (voir chapitre 5). La microscopie
dite à effet tunnel constitue la dernière née de ces
techniques de visualisation de molécules, mais ses
applications en biologie restent encore modestes.
1.5.1. C OLORATION NÉGATIVE
Le principe de la méthode est simple. Les particules à observer sont mises en suspension dans un
composé, ou «colorant », en solution aqueuse, et
ayant les propriétés suivantes : 1) grande solubilité, afin d’obtenir une concentration élevée, 2)
opacité aux électrons une fois l’eau évaporée, 3)
absence de formation de cristaux au séchage
(structure amorphe), et 4) stabilité au bombardement électronique.
On utilise en général l’acide phosphotungstique
dissous dans l’eau ;les particules suspendues dans
cette solution sont déposées sur des grilles de