3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
destruction des membranes par des détergents et
des parois (cas des cellules végétales ou des bactéries) par des enzymes appropriées (cellulases,
lysozyme…).
Les milieux de broyage répondent à des exigences chimiques et osmotiques : leur pH est
neutre et leur composition ionique aussi voisine
que possible de celle du cytoplasme. Ils sont en
outre tamponnés, car la destruction de la structure
cellulaire peut conduire à la libération de produits
ou à des réactions chimiques artefactuelles, susceptibles de faire varier le pH de l’homogénat. Ils
sont enfin osmotiquement équilibrés car de nombreux organites ou vésicules se comportent
comme des «sacs » sensibles à la pression osmotique du milieu aqueux environnant ;l eur volume
doit rester constant au cours de l’expérience, ce
qui semble être une garantie de leur intégrité. On
considère qu’une solution de saccharose 0,25 M est
isotonique vis-à-vis de la plupart des organites.
Selon la catégorie d’organites que l’on cherche à
purifier, la nature et la concentration des ions
contenus dans le milieu varient car elles déterminent de façon importante la structure et les propriétés physiologiques des organites isolés. Il
n’existe pas de milieu général d’homogénéisation ;
chaque type d’organite exige un protocole spécifique établi après de nombreux tâtonnements, et
qui diffère selon l’étude envisagée. Les conditions
générales du broyage doivent enfin limiter les
dégradations enzymatiques liées, par exemple, à la
destruction de certains organites tels que les lysosomes, qui libèrent alors des hydrolases, ou les
phénomènes d’oxydation par voie enzymatique,
particulièrement chez les Végétaux, riches en phénols. Le broyage, ainsi que les opérations suivantes, sont donc effectués à basse température
(0-4 °C), et le plus rapidement possible.
1.4.2. S ÉPARATION DES DIFFÉRENTES CATÉGORIES
D ’ ORGANITES ET STRUCTURES CELLULAIRES
Les différentes classes d’organites se distinguent
par leur taille, leur forme et leur densité ;les variations des deux premiers paramètres peuvent être
très grandes (les noyaux atteignent 10 µ m de diamètre tandis que les ribosomes mesurent 1520 nm) alors que celles relatives à la densité restent
faibles (de 1,1 environ pour les mitochondries, les
lysosomes ou les peroxysomes, à 1,6 pour les ribosomes). Dans le champ de gravité terrestre, ces
organites ou structures restent spontanément en
suspension au sein de l’homogénat et on n’obtient
aucune séparation en fractions distinctes.
Si l’on augmente artificiellement la valeur de ce
champ par centrifugation, ces particules se sédimentent avec une vitesse accrue et différente selon
leurs caractéristiques hydrodynamiques, de sorte
que l’on peut fractionner l’homogénat. Le principal
paramètre déterminant la vitesse de sédimentation
est la masse, de sorte que les particules les plus
grosses et les plus denses de l’homogénat forment
le premier sédiment (ou culot) rassemblé au fond
du tube à centrifuger, le liquide surnageant contenant les plus petites et les plus légères. Le surnageant et le culot sont séparés par décantation ;c e
dernier peut être resuspendu dans un nouveau
milieu, tandis que le surnageant peut être soumis
à une autre centrifugation qui sédimentera les particules encore en suspension.
Grâce à cette méthode, on peut obtenir rapidement des fractions relativement pures d’organites
en quantités importantes ;o n parle de technique
préparative. Il faut cependant noter que les sédiLa centrifugation différentielle
Grâce à une série de centrifugations de plus en
plus longues et donnant des champs de gravité
de plus en plus élevés, on fractionne l’extrait
initial en une série de culots et de surnageants.
On a déterminé de façon empirique les durées
et les valeurs des champs (c’est-à-dire les
vitesses de rotation, pour un rotor donné) de
façon à séparer les principales catégories
d’organites. Schématiquement, on peut donner
les ordres de grandeur suivants pour un protocole de fractionnement cellulaire de tissu animal (voir figure 3.10) ;c onditions pour obtenir,
sous forme de culot :
–gros débris et cellules entières : 5 minutes à
100 g;
–noyaux : 10 minutes à 1 000 g;
–mitochondries et lysosomes : 15 minutes à
10 000 g;
–débris membranaires et microsomes : 1 heure
à 100 000 g;
–ribosomes : 10 heures à 100 000 g.
E NCARTT ECHNIQUE
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destruction des membranes par des détergents et
des parois (cas des cellules végétales ou des bactéries) par des enzymes appropriées (cellulases,
lysozyme…).
Les milieux de broyage répondent à des exigences chimiques et osmotiques : leur pH est
neutre et leur composition ionique aussi voisine
que possible de celle du cytoplasme. Ils sont en
outre tamponnés, car la destruction de la structure
cellulaire peut conduire à la libération de produits
ou à des réactions chimiques artefactuelles, susceptibles de faire varier le pH de l’homogénat. Ils
sont enfin osmotiquement équilibrés car de nombreux organites ou vésicules se comportent
comme des «sacs » sensibles à la pression osmotique du milieu aqueux environnant ;l eur volume
doit rester constant au cours de l’expérience, ce
qui semble être une garantie de leur intégrité. On
considère qu’une solution de saccharose 0,25 M est
isotonique vis-à-vis de la plupart des organites.
Selon la catégorie d’organites que l’on cherche à
purifier, la nature et la concentration des ions
contenus dans le milieu varient car elles déterminent de façon importante la structure et les propriétés physiologiques des organites isolés. Il
n’existe pas de milieu général d’homogénéisation ;
chaque type d’organite exige un protocole spécifique établi après de nombreux tâtonnements, et
qui diffère selon l’étude envisagée. Les conditions
générales du broyage doivent enfin limiter les
dégradations enzymatiques liées, par exemple, à la
destruction de certains organites tels que les lysosomes, qui libèrent alors des hydrolases, ou les
phénomènes d’oxydation par voie enzymatique,
particulièrement chez les Végétaux, riches en phénols. Le broyage, ainsi que les opérations suivantes, sont donc effectués à basse température
(0-4 °C), et le plus rapidement possible.
1.4.2. S ÉPARATION DES DIFFÉRENTES CATÉGORIES
D ’ ORGANITES ET STRUCTURES CELLULAIRES
Les différentes classes d’organites se distinguent
par leur taille, leur forme et leur densité ;les variations des deux premiers paramètres peuvent être
très grandes (les noyaux atteignent 10 µ m de diamètre tandis que les ribosomes mesurent 1520 nm) alors que celles relatives à la densité restent
faibles (de 1,1 environ pour les mitochondries, les
lysosomes ou les peroxysomes, à 1,6 pour les ribosomes). Dans le champ de gravité terrestre, ces
organites ou structures restent spontanément en
suspension au sein de l’homogénat et on n’obtient
aucune séparation en fractions distinctes.
Si l’on augmente artificiellement la valeur de ce
champ par centrifugation, ces particules se sédimentent avec une vitesse accrue et différente selon
leurs caractéristiques hydrodynamiques, de sorte
que l’on peut fractionner l’homogénat. Le principal
paramètre déterminant la vitesse de sédimentation
est la masse, de sorte que les particules les plus
grosses et les plus denses de l’homogénat forment
le premier sédiment (ou culot) rassemblé au fond
du tube à centrifuger, le liquide surnageant contenant les plus petites et les plus légères. Le surnageant et le culot sont séparés par décantation ;c e
dernier peut être resuspendu dans un nouveau
milieu, tandis que le surnageant peut être soumis
à une autre centrifugation qui sédimentera les particules encore en suspension.
Grâce à cette méthode, on peut obtenir rapidement des fractions relativement pures d’organites
en quantités importantes ;o n parle de technique
préparative. Il faut cependant noter que les sédiLa centrifugation différentielle
Grâce à une série de centrifugations de plus en
plus longues et donnant des champs de gravité
de plus en plus élevés, on fractionne l’extrait
initial en une série de culots et de surnageants.
On a déterminé de façon empirique les durées
et les valeurs des champs (c’est-à-dire les
vitesses de rotation, pour un rotor donné) de
façon à séparer les principales catégories
d’organites. Schématiquement, on peut donner
les ordres de grandeur suivants pour un protocole de fractionnement cellulaire de tissu animal (voir figure 3.10) ;c onditions pour obtenir,
sous forme de culot :
–gros débris et cellules entières : 5 minutes à
100 g;
–noyaux : 10 minutes à 1 000 g;
–mitochondries et lysosomes : 15 minutes à
10 000 g;
–débris membranaires et microsomes : 1 heure
à 100 000 g;
–ribosomes : 10 heures à 100 000 g.
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