3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sérum par saignée. La purification des immunoglobulines spécifiques de l’antigène est effectuée
à partir de ce sérum ;
–les anticorps sont couplés par pontage covalent
(non dénaturant, à l’aide de glutaraldéhyde, par
exemple) à des molécules qui serviront de marqueurs permettant de les repérer facilement ;o n
parle alors de conjugués. Il peut s’agir : 1) de
fluorochromes, c’est-à-dire de substances qui
fluorescent lorsqu’on les excite avec une lumière
de longueur d’onde appropriée ; 2) de protéines
enzymatiques localisables grâce aux méthodes
de la cytoenzymologie : phosphatase, peroxydase ; 3) de protéines de type ferritine, qui ont la
propriété d’arrêter les électrons, en raison de
leur taille importante et de la présence de fer ; 4)
de petite billes d’or colloïdal, de quelques nanomètres de diamètre, opaques aux électrons. La
première de ces méthodes, nommée immunofluorescence, est utilisée en microscopie photonique seulement ;l es trois autres s’appliquent
à la microscopie photonique ou électronique (2)
ou à la microscopie électronique seule (3 et 4).
Le matériel biologique utilisé est constitué de
coupes histologiques ou de cellules entières, qui
sont mises en contact avec les anticorps marqués
en solution dans un tampon adéquat. La formation
du complexe anticorps/antigène ne peut évidemment s’effectuer que si un contact physique est
possible entre les deux partenaires. Ceci ne pose
pas de problèmes dans le cas des coupes mais
devient difficile avec des cellules entières, en raison de la présence de la membrane plasmique et
de la taille importante des complexes macromoléculaires manipulés. Il est possible, bien que délicat, d’injecter des anticorps marqués dans des
cellules vivantes et de suivre les événements in
vivo. De façon habituelle, les cellules entières préalablement fixées sont perméabilisées par des détergents doux ou des solvants organiques qui font
des «pores » dans la membrane plasmique sans
détruire l’organisation et les structures cellulaires ;
ce traitement résout les problèmes d’accessibilité
des anticorps greffés.
Lorsque la reconnaissance antigène/anticorps
marqué a eu lieu, le matériel doit être soigneusement lavé pour éliminer les excédents d’anticorps
non fixé et éviter un signal non spécifique.
La dernière étape consiste dans la visualisation
des complexes ainsi formés ;s elon le type de marquage des anticorps, on procède à une observation
directe de la fluorescence ou des particules de ferritine ou d’or colloïdal, mais on peut aussi mettre
en œuvre sur les coupes la réaction enzymatique
permettant de repérer les enzymes-marqueurs
(voir figure 3.8).
Cette technique déjà ancienne, utilisant un seul
anticorps marqué, porte le nom d’immunocytochimie directe ; une version plus récente de ce protocole, tout aussi spécifique, mais plus sensible :
l’immunocytochimie indirecte ,s era décrite plus
loin. Celle-ci a connu un développement important dans le cadre de l’étude des structures constituant le cytosquelette des cellules eucaryotiques.
La microscopie confocale, qui permet l’étude
d’objets transparents épais et fournit cependant
des images en fluorescence d’une exceptionnelle
lisibilité, représente le dernier progrès associé à
cette technique (voir chapitre 11).
1.3.4. H YBRIDATION IN SITU ( SONDES NUCLÉIQUES)
De même que l’immunocytochimie permet de
localiser des protéines au sein des structures cellulaires, la technique dite d’hybridation in situ permet de repérer des séquences particulières d’acides
nucléiques en place. Cette méthode est basée sur la
propriété bien connue, que présentent ces molécules, de reconstituer des hybrides double-brins
stables, après avoir subi une dénaturation préalable. Lorsque l’on dispose d’une séquence donnée
d’ADN ou d’ARN en quantité suffisante, on peut
utiliser celle-ci comme sonde pour mettre en éviFigure 3.8
Principe de l’immunocytochimie directe
L’antigène cible (triangle coloré), au sein d’une coupe ou
d’une cellule entière (1), est spécifiquement reconnu par
l’anticorps correspondant, auquel a été greffé, selon les
cas, une enzyme, de la ferritine, de l’or colloïdal ou un
fluorochrome (2). L’exemple de l’immunofluorescence
(3) est illustré ici.
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sérum par saignée. La purification des immunoglobulines spécifiques de l’antigène est effectuée
à partir de ce sérum ;
–les anticorps sont couplés par pontage covalent
(non dénaturant, à l’aide de glutaraldéhyde, par
exemple) à des molécules qui serviront de marqueurs permettant de les repérer facilement ;o n
parle alors de conjugués. Il peut s’agir : 1) de
fluorochromes, c’est-à-dire de substances qui
fluorescent lorsqu’on les excite avec une lumière
de longueur d’onde appropriée ; 2) de protéines
enzymatiques localisables grâce aux méthodes
de la cytoenzymologie : phosphatase, peroxydase ; 3) de protéines de type ferritine, qui ont la
propriété d’arrêter les électrons, en raison de
leur taille importante et de la présence de fer ; 4)
de petite billes d’or colloïdal, de quelques nanomètres de diamètre, opaques aux électrons. La
première de ces méthodes, nommée immunofluorescence, est utilisée en microscopie photonique seulement ;l es trois autres s’appliquent
à la microscopie photonique ou électronique (2)
ou à la microscopie électronique seule (3 et 4).
Le matériel biologique utilisé est constitué de
coupes histologiques ou de cellules entières, qui
sont mises en contact avec les anticorps marqués
en solution dans un tampon adéquat. La formation
du complexe anticorps/antigène ne peut évidemment s’effectuer que si un contact physique est
possible entre les deux partenaires. Ceci ne pose
pas de problèmes dans le cas des coupes mais
devient difficile avec des cellules entières, en raison de la présence de la membrane plasmique et
de la taille importante des complexes macromoléculaires manipulés. Il est possible, bien que délicat, d’injecter des anticorps marqués dans des
cellules vivantes et de suivre les événements in
vivo. De façon habituelle, les cellules entières préalablement fixées sont perméabilisées par des détergents doux ou des solvants organiques qui font
des «pores » dans la membrane plasmique sans
détruire l’organisation et les structures cellulaires ;
ce traitement résout les problèmes d’accessibilité
des anticorps greffés.
Lorsque la reconnaissance antigène/anticorps
marqué a eu lieu, le matériel doit être soigneusement lavé pour éliminer les excédents d’anticorps
non fixé et éviter un signal non spécifique.
La dernière étape consiste dans la visualisation
des complexes ainsi formés ;s elon le type de marquage des anticorps, on procède à une observation
directe de la fluorescence ou des particules de ferritine ou d’or colloïdal, mais on peut aussi mettre
en œuvre sur les coupes la réaction enzymatique
permettant de repérer les enzymes-marqueurs
(voir figure 3.8).
Cette technique déjà ancienne, utilisant un seul
anticorps marqué, porte le nom d’immunocytochimie directe ; une version plus récente de ce protocole, tout aussi spécifique, mais plus sensible :
l’immunocytochimie indirecte ,s era décrite plus
loin. Celle-ci a connu un développement important dans le cadre de l’étude des structures constituant le cytosquelette des cellules eucaryotiques.
La microscopie confocale, qui permet l’étude
d’objets transparents épais et fournit cependant
des images en fluorescence d’une exceptionnelle
lisibilité, représente le dernier progrès associé à
cette technique (voir chapitre 11).
1.3.4. H YBRIDATION IN SITU ( SONDES NUCLÉIQUES)
De même que l’immunocytochimie permet de
localiser des protéines au sein des structures cellulaires, la technique dite d’hybridation in situ permet de repérer des séquences particulières d’acides
nucléiques en place. Cette méthode est basée sur la
propriété bien connue, que présentent ces molécules, de reconstituer des hybrides double-brins
stables, après avoir subi une dénaturation préalable. Lorsque l’on dispose d’une séquence donnée
d’ADN ou d’ARN en quantité suffisante, on peut
utiliser celle-ci comme sonde pour mettre en éviFigure 3.8
Principe de l’immunocytochimie directe
L’antigène cible (triangle coloré), au sein d’une coupe ou
d’une cellule entière (1), est spécifiquement reconnu par
l’anticorps correspondant, auquel a été greffé, selon les
cas, une enzyme, de la ferritine, de l’or colloïdal ou un
fluorochrome (2). L’exemple de l’immunofluorescence
(3) est illustré ici.
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