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B IOLOGIE CELLULAIRE
pas la coloration qui est spécifique, mais uniquement le traitement qui élimine le composé étudié.
Deux exemples de réactions classiques, mais
n’ayant plus qu’un intérêt historique, seront brièvement décrites dans les chapitres 7 et 8;i l s’agit
de la réaction de Feulgen (spécifique de l’ADN),
et de la réaction dite à l’APS (mettant en évidence
les polysaccharides).
Divers composés sont actuellement utilisés pour
localiser des espèces macromoléculaires particulières sur des coupes ou dans des cellules entières ;
bien que ces substances se fixent sur leurs cibles
par des liaisons faibles, elles le font avec avec une
haute affinité et une excellente spécificité. On peut
citer deux colorants des noyaux, qui se fixent sur
l’ADN et sont visibles par fluorescence : le BET
(bromure d’éthidium) et le DAPI (diamidino-phénylindole) ;le premier s’intercale entre les plateaux
de bases et le second se loge dans un des sillons
externes de la molécule. Le complexe formé par
l’ADN et la molécule adsorbée est fluorescent
alors que les deux partenaires séparés ne le sont
pas. De même, le composé nommé calcofluor permet de visualiser par fluorescence la cellulose
contenue dans la paroi des cellules végétales.
1.3.2. L ECTINES
Ces composés sont largement utilisés pour
mettre en évidence des motifs glucidiques de la
surface cellulaire. Il s’agit de protéines ou de glycoprotéines principalement d’origine végétale et
extraites initialement des graines de légumineuses
(qui en sont très riches) ;d es protéines ayant des
propriétés équivalentes existent chez les animaux.
Grâce à certains sites particuliers de leur surface,
celles-ci se lient avec une grande affinité à des
groupements glucidiques spécifiques : glucose,
mannose, galactose, fucose, N acétyl-glucosamine…, rencontrés au niveau des glycoprotéines
ou des protéoglycanes présents à la surface des
cellules. De même que les anticorps (voir plus
loin), les lectines peuvent être marquées par des
fluorochromes ou des molécules permettant de les
visualiser aisément en microscopie optique ou
électronique (ferritine, peroxydase…), soit directement, soit par le biais d’une réaction enzymatique.
Les lectines servent aussi bien d’outils en cytologie, pour caractériser des protéines de surface,
qu’en biochimie pour les isoler et les purifier (en
tant que ligand dans une chromatographie d’affinité). La concanavaline A est la plus anciennement connue de ces molécules qui ont en outre la
propriété d’agglutiner les cellules porteuses des
résidus glucidiques qui leur sont spécifiques (d’où
leur ancien nom de phytohémagglutinines). Pour
cette raison, les lectines sont largement utilisées
dans la caractérisation des populations cellulaires,
en particulier les cellules sanguines. On a observé,
à cette occasion, qu’elles stimulent la division de
certains lymphocytes ;c ette propriété est utilisée
pour l’établissement des caryotypes (voir
chapitre 12). Le rôle physiologique exact de la plupart de ces molécules, dans les cellules qui les
fabriquent, reste encore inconnu.
1.3.3. I MMUNOCYTOCHIMIE
Cette technique, qui constitue une branche relativement récente de la cytologie (voir chapitre 1)
permet une localisation très précise des macromolécules, à l’échelle structurale ou ultrastructurale.
Comme son nom le suggère, la méthode utilise
comme outils les anticorps, la spécificité de la
reconnaissance étant basée sur la réaction immunitaire de formation des complexes antigène/anticorps. On appelle antigène toute molécule (en
général une macromolécule : protéine, polysaccharide, acide nucléique) susceptible de provoquer,
lorsqu’on l’injecte à un Mammifère, la production
dans son sang de protéines spécifiques appelées
anticorps (famille des immunoglobulines). Les
antigènes injectés sont reconnus comme étrangers
par l’organisme receveur, qui déclenche une
réponse défensive au cours de laquelle les complexes antigène/anticorps seront éliminés par voie
phagocytaire ( via des globules blancs particuliers).
C’est cette propriété unique de reconnaissance
précise entre macromolécules qui est utilisée dans
la technique immunocytochimique.
Les étapes d’obtention d’un anticorps antiprotéine, dit polyclonal, utilisable en immunocytochimie sont les suivantes :
–la protéine que l’on veut localiser doit être très
soigneusement purifiée, ce qui implique un
important travail biochimique préliminaire. La
technique des anticorps monoclonaux simplifie
ce protocole en supprimant cette étape longue et
délicate (voir chapitre 11) ;
– des injections répétées de la molécule antigénique
à un même animal (d’une espèce différente de
celle qui a éventuellement servi à la fournir) provoquent la fabrication, par ce dernier, d’anticorps que l’on peut récupérer en prélevant le
B IOLOGIE CELLULAIRE
pas la coloration qui est spécifique, mais uniquement le traitement qui élimine le composé étudié.
Deux exemples de réactions classiques, mais
n’ayant plus qu’un intérêt historique, seront brièvement décrites dans les chapitres 7 et 8;i l s’agit
de la réaction de Feulgen (spécifique de l’ADN),
et de la réaction dite à l’APS (mettant en évidence
les polysaccharides).
Divers composés sont actuellement utilisés pour
localiser des espèces macromoléculaires particulières sur des coupes ou dans des cellules entières ;
bien que ces substances se fixent sur leurs cibles
par des liaisons faibles, elles le font avec avec une
haute affinité et une excellente spécificité. On peut
citer deux colorants des noyaux, qui se fixent sur
l’ADN et sont visibles par fluorescence : le BET
(bromure d’éthidium) et le DAPI (diamidino-phénylindole) ;le premier s’intercale entre les plateaux
de bases et le second se loge dans un des sillons
externes de la molécule. Le complexe formé par
l’ADN et la molécule adsorbée est fluorescent
alors que les deux partenaires séparés ne le sont
pas. De même, le composé nommé calcofluor permet de visualiser par fluorescence la cellulose
contenue dans la paroi des cellules végétales.
1.3.2. L ECTINES
Ces composés sont largement utilisés pour
mettre en évidence des motifs glucidiques de la
surface cellulaire. Il s’agit de protéines ou de glycoprotéines principalement d’origine végétale et
extraites initialement des graines de légumineuses
(qui en sont très riches) ;d es protéines ayant des
propriétés équivalentes existent chez les animaux.
Grâce à certains sites particuliers de leur surface,
celles-ci se lient avec une grande affinité à des
groupements glucidiques spécifiques : glucose,
mannose, galactose, fucose, N acétyl-glucosamine…, rencontrés au niveau des glycoprotéines
ou des protéoglycanes présents à la surface des
cellules. De même que les anticorps (voir plus
loin), les lectines peuvent être marquées par des
fluorochromes ou des molécules permettant de les
visualiser aisément en microscopie optique ou
électronique (ferritine, peroxydase…), soit directement, soit par le biais d’une réaction enzymatique.
Les lectines servent aussi bien d’outils en cytologie, pour caractériser des protéines de surface,
qu’en biochimie pour les isoler et les purifier (en
tant que ligand dans une chromatographie d’affinité). La concanavaline A est la plus anciennement connue de ces molécules qui ont en outre la
propriété d’agglutiner les cellules porteuses des
résidus glucidiques qui leur sont spécifiques (d’où
leur ancien nom de phytohémagglutinines). Pour
cette raison, les lectines sont largement utilisées
dans la caractérisation des populations cellulaires,
en particulier les cellules sanguines. On a observé,
à cette occasion, qu’elles stimulent la division de
certains lymphocytes ;c ette propriété est utilisée
pour l’établissement des caryotypes (voir
chapitre 12). Le rôle physiologique exact de la plupart de ces molécules, dans les cellules qui les
fabriquent, reste encore inconnu.
1.3.3. I MMUNOCYTOCHIMIE
Cette technique, qui constitue une branche relativement récente de la cytologie (voir chapitre 1)
permet une localisation très précise des macromolécules, à l’échelle structurale ou ultrastructurale.
Comme son nom le suggère, la méthode utilise
comme outils les anticorps, la spécificité de la
reconnaissance étant basée sur la réaction immunitaire de formation des complexes antigène/anticorps. On appelle antigène toute molécule (en
général une macromolécule : protéine, polysaccharide, acide nucléique) susceptible de provoquer,
lorsqu’on l’injecte à un Mammifère, la production
dans son sang de protéines spécifiques appelées
anticorps (famille des immunoglobulines). Les
antigènes injectés sont reconnus comme étrangers
par l’organisme receveur, qui déclenche une
réponse défensive au cours de laquelle les complexes antigène/anticorps seront éliminés par voie
phagocytaire ( via des globules blancs particuliers).
C’est cette propriété unique de reconnaissance
précise entre macromolécules qui est utilisée dans
la technique immunocytochimique.
Les étapes d’obtention d’un anticorps antiprotéine, dit polyclonal, utilisable en immunocytochimie sont les suivantes :
–la protéine que l’on veut localiser doit être très
soigneusement purifiée, ce qui implique un
important travail biochimique préliminaire. La
technique des anticorps monoclonaux simplifie
ce protocole en supprimant cette étape longue et
délicate (voir chapitre 11) ;
– des injections répétées de la molécule antigénique
à un même animal (d’une espèce différente de
celle qui a éventuellement servi à la fournir) provoquent la fabrication, par ce dernier, d’anticorps que l’on peut récupérer en prélevant le