3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
53
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
du tube une d = 1,8, et en haut du tube une d = 1,6
(tous les intermédiaires de concentration existant
entre ces extrêmes). Pour obtenir cela, il faut des
ultracentrifugeuses fournissant des accélérations
de plus de 200 000 g et tournant pendant plusieurs
dizaines d’heures.
Ce dernier type de gradient a été historiquement
très utilisé pour la séparation des molécules
d’ADN. En solution, celles-ci ont une densité qui
est fonction de leur composition en bases ;b ien
que les différences de densité observées soient
infimes, elles peuvent être discriminées par un
gradient de CsCl. Après centrifugation d’une solution d’ADN en CsCl, on obtient le long du tube
autant de bandes stables qu’il y a de populations
de molécules d’ADN distinctes par leur densité de
flottaison, indépendamment de leur taille (qui
n’entre pas en ligne de compte dans la séparation).
Par cette technique, on peut aussi séparer des
ADN dont les différences de densité sont dues à la
présence d’isotopes lourds (ADN contenant par
exemple du
15
N au lieu du
14
N normal ; voir plus
loin). Ces méthodes de centrifugation analytique
de protéines ou d’acides nucléiques, abondamment utilisées dans les années 60-70, mais très
lourdes, ont été supplantées par les techniques
d’électrophorèse, bien plus légères et pratiques et
surtout infiniment plus résolutives.
1.3. Outils et techniques cytologiques
d’identification de molécules in situ
Les méthodes d’identification des structures
cellulaires, décrites dans le chapitre 2, sont basées
sur l’utilisation de colorants qui s’adsorbent sur
celles-ci de manière plus ou moins élective. Seules
des liaisons électrostatiques faibles, de type
ionique ou hydrogène, sont responsables de l’affinité entre colorant et structure cible. Par exemple,
en simplifiant, un colorant dit «basique » se fixe
plutôt sur des structures «acides »;o n parle de
colorants acidophiles ou basophiles. Cependant,
les structures et les organites cellulaires sont en
général constitués de plusieurs catégories de
macromolécules ayant des propriétés très diverses,
de sorte qu’on ne sait jamais quelles molécules
réagissent, et selon quels mécanismes, dans ce
genre de coloration.
Des techniques et des outils de plus en plus raffinés ont été mis au point, qui permettent une
identification directe des constituants chimiques
au niveau des structures cellulaires en place, sur
des coupes ou dans des cellules entières (études
dites in situ). Si les méthodes les plus anciennes
permettaient seulement de localiser des grands
groupes de macromolécules, celles que l’on
emploie à l’heure actuelle concernent des espèces
moléculaires uniques. L’approche nommée cytochimie, qui a connu un développement important
dans les années 60, a été relayée par l’immunocytochimie et une technique utilisant comme outils
des sondes nucléiques, grâce auxquelles n’importe
quelle protéine ou acide nucléique peut théoriquement être repérée avec précision dans la cellule,
parmi des milliers d’autres.
1.3.1. C YTOCHIMIE
Dans cette approche, la spécificité de la réponse
colorée est liée soit à l’utilisation de méthodes et
de réactions employées en chimie organique, soit à
l’utilisation d’enzymes détruisant sélectivement le
composé recherché. Dans le premier cas, on caractérise des groupements fonctionnels précis, préexistants ou démasqués par un traitement
approprié, tels que les fonctions alcool, aldéhyde
ou cétone, amine… ;l a spécificité de la détection
peut donc ne pas tenir seulement au colorant mais
aussi au traitement préalable que l’on fait subir
aux préparations. Dans le deuxième cas, ce n’est
état initial
après centrifugation
à l'équilibre
macromolécules
dissoutes dans
CsCI 6 M
Figure 3.7
Centrifugation en gradient de densité à l’équilibre
(gradient autoformé de CsCl)
L’échantillon (en général, des acides nucléiques) est au
départ dissous dans la solution de CsCl au sein de
laquelle s’établit, au cours de la centrifugation, un gradient continu de concentration et de densité. Les molécules se séparent en bandes selon leur seule densité et
restent ainsi à l’équilibre.
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
du tube une d = 1,8, et en haut du tube une d = 1,6
(tous les intermédiaires de concentration existant
entre ces extrêmes). Pour obtenir cela, il faut des
ultracentrifugeuses fournissant des accélérations
de plus de 200 000 g et tournant pendant plusieurs
dizaines d’heures.
Ce dernier type de gradient a été historiquement
très utilisé pour la séparation des molécules
d’ADN. En solution, celles-ci ont une densité qui
est fonction de leur composition en bases ;b ien
que les différences de densité observées soient
infimes, elles peuvent être discriminées par un
gradient de CsCl. Après centrifugation d’une solution d’ADN en CsCl, on obtient le long du tube
autant de bandes stables qu’il y a de populations
de molécules d’ADN distinctes par leur densité de
flottaison, indépendamment de leur taille (qui
n’entre pas en ligne de compte dans la séparation).
Par cette technique, on peut aussi séparer des
ADN dont les différences de densité sont dues à la
présence d’isotopes lourds (ADN contenant par
exemple du
15
N au lieu du
14
N normal ; voir plus
loin). Ces méthodes de centrifugation analytique
de protéines ou d’acides nucléiques, abondamment utilisées dans les années 60-70, mais très
lourdes, ont été supplantées par les techniques
d’électrophorèse, bien plus légères et pratiques et
surtout infiniment plus résolutives.
1.3. Outils et techniques cytologiques
d’identification de molécules in situ
Les méthodes d’identification des structures
cellulaires, décrites dans le chapitre 2, sont basées
sur l’utilisation de colorants qui s’adsorbent sur
celles-ci de manière plus ou moins élective. Seules
des liaisons électrostatiques faibles, de type
ionique ou hydrogène, sont responsables de l’affinité entre colorant et structure cible. Par exemple,
en simplifiant, un colorant dit «basique » se fixe
plutôt sur des structures «acides »;o n parle de
colorants acidophiles ou basophiles. Cependant,
les structures et les organites cellulaires sont en
général constitués de plusieurs catégories de
macromolécules ayant des propriétés très diverses,
de sorte qu’on ne sait jamais quelles molécules
réagissent, et selon quels mécanismes, dans ce
genre de coloration.
Des techniques et des outils de plus en plus raffinés ont été mis au point, qui permettent une
identification directe des constituants chimiques
au niveau des structures cellulaires en place, sur
des coupes ou dans des cellules entières (études
dites in situ). Si les méthodes les plus anciennes
permettaient seulement de localiser des grands
groupes de macromolécules, celles que l’on
emploie à l’heure actuelle concernent des espèces
moléculaires uniques. L’approche nommée cytochimie, qui a connu un développement important
dans les années 60, a été relayée par l’immunocytochimie et une technique utilisant comme outils
des sondes nucléiques, grâce auxquelles n’importe
quelle protéine ou acide nucléique peut théoriquement être repérée avec précision dans la cellule,
parmi des milliers d’autres.
1.3.1. C YTOCHIMIE
Dans cette approche, la spécificité de la réponse
colorée est liée soit à l’utilisation de méthodes et
de réactions employées en chimie organique, soit à
l’utilisation d’enzymes détruisant sélectivement le
composé recherché. Dans le premier cas, on caractérise des groupements fonctionnels précis, préexistants ou démasqués par un traitement
approprié, tels que les fonctions alcool, aldéhyde
ou cétone, amine… ;l a spécificité de la détection
peut donc ne pas tenir seulement au colorant mais
aussi au traitement préalable que l’on fait subir
aux préparations. Dans le deuxième cas, ce n’est
état initial
après centrifugation
à l'équilibre
macromolécules
dissoutes dans
CsCI 6 M
Figure 3.7
Centrifugation en gradient de densité à l’équilibre
(gradient autoformé de CsCl)
L’échantillon (en général, des acides nucléiques) est au
départ dissous dans la solution de CsCl au sein de
laquelle s’établit, au cours de la centrifugation, un gradient continu de concentration et de densité. Les molécules se séparent en bandes selon leur seule densité et
restent ainsi à l’équilibre.