52
B IOLOGIE CELLULAIRE
même des particules de très petite taille et présentant de très faibles différences dans leurs caractéristiques peuvent être séparées. On distingue deux
types de protocoles utilisant soit des gradients préformés de saccharose, soit des gradients «autoformés » de chlorure de césium (CsCl).
• Dans la technique du gradient préformé, le
tube à centrifuger contient une solution de saccharose ou de glycérol dont la concentration varie de
façon régulière et décroissante du bas vers le haut
du tube. Cette variation peut être linéaire et continue ou bien discontinue et par paliers ;d ans les
deux cas, la viscosité et la densité évoluent dans le
même sens que la concentration. On dépose à la
surface du gradient une fine couche de l’échantillon
dont on veut séparer les constituants ;o n centrifuge ensuite dans un rotor à godets mobiles, qui se
mettent à l’horizontale lors de sa rotation, pour ne
pas perturber la géométrie du système.
Comme les paramètres déterminant la vitesse
de sédimentation des particules contenues dans
l’échantillon évoluent au cours de leur descente le
long du gradient, celles-ci se séparent efficacement
et migrent en classes homogènes, formant des
bandes le long du tube ( centrifugation dite parfois
zonale);l a séparation est obtenue en une seule
étape. Cependant, si la centrifugation se prolonge
et si les particules ont une densité supérieure à
celle de toutes les couches de saccharose, elles les
traverseront toutes et se sédimenteront finalement
au fond du tube. La durée de l’opération doit donc
être contrôlée, selon ce que l’on cherche à séparer.
La récolte du matériel se fait en perçant le fond du
tube et en récupérant goutte à goutte le gradient
dans une série de tubes (voir figure 3.6).
Cette technique a historiquement permis de
séparer les ribosomes entiers ou leurs sous-unités,
les divers ARN (m, r, t), un grand nombre de protéines ou de Virus…, et de leur attribuer un coefficient de sédimentation caractéristique. Celui-ci est
proportionnel à la taille de la particule, mais la
forme de cette dernière peut moduler sa valeur ;il
est exprimé en unités Svedberg (S) et on parle ainsi
d’ARN 18 S, 28 S, 5 S…
Cette méthode s’applique aussi aux organites
cellulaires et complète efficacement la centrifugation dite différentielle, qui sera examinée plus
loin. Cependant, elle ne permet de manipuler que
de petits volumes de matériel biologique, et reste
une technique essentiellement analytique (par
opposition aux techniques préparatives).
• La technique du gradient de densité à l’équilibre utilise aussi, dans le tube à centrifuger, une
variation continue de concentration d’un composé
dont la densité décroît régulièrement du bas vers
le haut. La solution constituant ce gradient est à
base de saccharose (gradient préformé, comme
précédemment), ou bien de CsCl ( gradient autoformé ; voir plus loin) ;l ’échantillon à analyser
peut, ici aussi, être déposé à la surface du liquide.
Le principe est, dans ce type d’expérience, que les
particules ou les espèces moléculaires se séparent
sur la base de leur seule densité. Au cours de la
centrifugation, celles-ci se sédimentent jusqu’à
atteindre le niveau du gradient où le liquide a exactement leur densité, et elles forment une bande.
Ceci réalisé, elles ne bougent plus de cette position
d’équilibre, quelle que soit la durée de la centrifugation (voir figure 3.7). La collecte des fractions se
fait par le bas, comme précédemment.
Si l’on centrifuge très fortement une solution
concentrée de CsCl (ions Cs
+
et Cl
–
), les ions Cs
+
,
très denses, ont tendance à se sédimenter au fond
du tube comme le font des particules dans l’eau. Il
s’établit alors progressivement un gradient de
concentration (dit autoformé), et donc un gradient
de densité (voir figure 3.7). Si l’on part d’une solution homogène de d = 1,7, on peut obtenir en bas
état initial
au temps t
20%
de saccharose
60 %
de saccharose
macromolécules
déposées sur
le gradient
gradient
préformé de
saccharose
Figure 3.6
Technique de centrifugation dite du gradient
de vitesse de sédimentation,
dans laquelle on utilise un gradient préformé
Les particules de l’échantillon, déposé au sommet du
tube, sont séparées en bandes selon leur vitesse de sédimentation. La centrifugation doit être interrompue avant
que les particules n’aient atteint le fond du tube. Certaines peuvent cependant atteindre une position d’équilibre de densité après quelque temps de centrifugation.
B IOLOGIE CELLULAIRE
même des particules de très petite taille et présentant de très faibles différences dans leurs caractéristiques peuvent être séparées. On distingue deux
types de protocoles utilisant soit des gradients préformés de saccharose, soit des gradients «autoformés » de chlorure de césium (CsCl).
• Dans la technique du gradient préformé, le
tube à centrifuger contient une solution de saccharose ou de glycérol dont la concentration varie de
façon régulière et décroissante du bas vers le haut
du tube. Cette variation peut être linéaire et continue ou bien discontinue et par paliers ;d ans les
deux cas, la viscosité et la densité évoluent dans le
même sens que la concentration. On dépose à la
surface du gradient une fine couche de l’échantillon
dont on veut séparer les constituants ;o n centrifuge ensuite dans un rotor à godets mobiles, qui se
mettent à l’horizontale lors de sa rotation, pour ne
pas perturber la géométrie du système.
Comme les paramètres déterminant la vitesse
de sédimentation des particules contenues dans
l’échantillon évoluent au cours de leur descente le
long du gradient, celles-ci se séparent efficacement
et migrent en classes homogènes, formant des
bandes le long du tube ( centrifugation dite parfois
zonale);l a séparation est obtenue en une seule
étape. Cependant, si la centrifugation se prolonge
et si les particules ont une densité supérieure à
celle de toutes les couches de saccharose, elles les
traverseront toutes et se sédimenteront finalement
au fond du tube. La durée de l’opération doit donc
être contrôlée, selon ce que l’on cherche à séparer.
La récolte du matériel se fait en perçant le fond du
tube et en récupérant goutte à goutte le gradient
dans une série de tubes (voir figure 3.6).
Cette technique a historiquement permis de
séparer les ribosomes entiers ou leurs sous-unités,
les divers ARN (m, r, t), un grand nombre de protéines ou de Virus…, et de leur attribuer un coefficient de sédimentation caractéristique. Celui-ci est
proportionnel à la taille de la particule, mais la
forme de cette dernière peut moduler sa valeur ;il
est exprimé en unités Svedberg (S) et on parle ainsi
d’ARN 18 S, 28 S, 5 S…
Cette méthode s’applique aussi aux organites
cellulaires et complète efficacement la centrifugation dite différentielle, qui sera examinée plus
loin. Cependant, elle ne permet de manipuler que
de petits volumes de matériel biologique, et reste
une technique essentiellement analytique (par
opposition aux techniques préparatives).
• La technique du gradient de densité à l’équilibre utilise aussi, dans le tube à centrifuger, une
variation continue de concentration d’un composé
dont la densité décroît régulièrement du bas vers
le haut. La solution constituant ce gradient est à
base de saccharose (gradient préformé, comme
précédemment), ou bien de CsCl ( gradient autoformé ; voir plus loin) ;l ’échantillon à analyser
peut, ici aussi, être déposé à la surface du liquide.
Le principe est, dans ce type d’expérience, que les
particules ou les espèces moléculaires se séparent
sur la base de leur seule densité. Au cours de la
centrifugation, celles-ci se sédimentent jusqu’à
atteindre le niveau du gradient où le liquide a exactement leur densité, et elles forment une bande.
Ceci réalisé, elles ne bougent plus de cette position
d’équilibre, quelle que soit la durée de la centrifugation (voir figure 3.7). La collecte des fractions se
fait par le bas, comme précédemment.
Si l’on centrifuge très fortement une solution
concentrée de CsCl (ions Cs
+
et Cl
–
), les ions Cs
+
,
très denses, ont tendance à se sédimenter au fond
du tube comme le font des particules dans l’eau. Il
s’établit alors progressivement un gradient de
concentration (dit autoformé), et donc un gradient
de densité (voir figure 3.7). Si l’on part d’une solution homogène de d = 1,7, on peut obtenir en bas
état initial
au temps t
20%
de saccharose
60 %
de saccharose
macromolécules
déposées sur
le gradient
gradient
préformé de
saccharose
Figure 3.6
Technique de centrifugation dite du gradient
de vitesse de sédimentation,
dans laquelle on utilise un gradient préformé
Les particules de l’échantillon, déposé au sommet du
tube, sont séparées en bandes selon leur vitesse de sédimentation. La centrifugation doit être interrompue avant
que les particules n’aient atteint le fond du tube. Certaines peuvent cependant atteindre une position d’équilibre de densité après quelque temps de centrifugation.