3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
51
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
approximativement proportionnelle à leur masse ;
la séparation s’effectue sur un support poreux serré
(gel d’agarose ou de polyacrylamide) qui sépare les
molécules selon leur taille, les plus petites migrant
le plus rapidement ( électrophorèse dénaturante).
• Sur la base de ces principes a d’abord été
développée l’électrophorèse monodimensionnelle,
dans laquelle les différents polypeptides ou protéines sont séparés en ligne, le long d’un seul
canal ;c ette méthode permet de distinguer seulement 100 à 200 fractions dans un échantillon qui
peut contenir un millier d’espèces moléculaires.
L’électrophorèse bidimensionnelle combine
deux types de migration conduits dans deux
dimensions perpendiculaires l’une à l’autre. La
première migration sépare les protéines natives de
l’échantillon selon leur pH isoélectrique (focalisation isoélectrique) et la seconde, leurs éventuels
polypeptides constitutifs, selon la taille, après
dénaturation par le SDS. De cette façon, les différents éléments d’un mélange sont répartis sur une
grande surface, ce qui augmente considérablement
la résolution de la séparation ;on peut ainsi discerner plus de 10 00 taches correspondant chacune à
un polypeptide (voir figure 3.4).
En raison de leur organisation moléculaire et de
leur charge négative, les acides nucléiques linéaires
sont directement séparables en fonction de leur
taille, par électrophorèse sur un gel poreux serré.
La technique récente d’électrophorèse en champ
pulsé permet la séparation de molécules d’ADN
de très grande taille, allant jusqu’à des chromosomes eucaryotiques entiers ;l es 16 chromosomes
de la levure de bière sont ainsi obtenus individuellement, préalable indispensable à leur cartographie et à leur séquençage complets (voir figure 3.5).
1.2.2. U LTRACENTRIFUGATION
La séparation de particules biologiques allant
des petites macromolécules (protéines) jusqu’aux
gros édifices supramoléculaires (ribosomes, Virus)
peut être obtenue par cette technique. En fonction
du protocole mis en œuvre, celle-ci conduit à séparer les particules selon : 1) pour l’essentiel, leur
taille et leur forme, ou 2) uniquement leur densité,
indépendamment de ces deux paramètres.
Les ultracentrifugeuses sont des machines très
sophistiquées par rapport aux centrifugeuses classiques ;l eurs rotors peuvent tourner jusqu’à près
de 80 000 tours par minute, et ils fournissent des
champs de gravité atteignant 500 000 fois la gravité terrestre. Dans ces conditions, et en utilisant la
technique dite de centrifugation en gradient,
Figure 3.4
Séparation de protéines dénaturées par électrophorèse
monodimensionnelle (à gauche) et bidimensionnelle
(à droite), sur gels de polyacrylamide
Dans le premier cas, chaque canal correspond à un
échantillon de protéines donné, tandis que dans le
second, un seul échantillon est traité et tous les polypeptides du mélange sont répartis sur l’ensemble du gel
(dont seule une partie est montrée ici). Les différentes
bandes ou spots sont visualisées par des colorants tels
que le bleu de Coomassie ou le nitrate d’argent. (Clichés
Labo BG et MVE, Orsay).
1 2 3
kb
9,4
6,6
4,4
2,3
2,0
kb
1900 /1 640
1120 / 1100
945
915
815
785
680
745
610
555
450
375
295
225
Figure 3.5
Électrophorèses monodimensionnelles d’acides
nucléiques sur gels de polyacrylamide
À gauche, séparation d’échantillons d’ADNmt
d’Amphibiens digérés par des enzymes de restriction.
À droite, séparation des 16 chromosomes de la levure
par électrophorèse en champ pulsé.
La taille des différentes molécules d’ADN est indiquée
en kb. Noter la différence considérable de résolution que
permettent ces deux techniques (sens de la migration
indiqué par la flèche). (Clichés Labo BG, Orsay).
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
approximativement proportionnelle à leur masse ;
la séparation s’effectue sur un support poreux serré
(gel d’agarose ou de polyacrylamide) qui sépare les
molécules selon leur taille, les plus petites migrant
le plus rapidement ( électrophorèse dénaturante).
• Sur la base de ces principes a d’abord été
développée l’électrophorèse monodimensionnelle,
dans laquelle les différents polypeptides ou protéines sont séparés en ligne, le long d’un seul
canal ;c ette méthode permet de distinguer seulement 100 à 200 fractions dans un échantillon qui
peut contenir un millier d’espèces moléculaires.
L’électrophorèse bidimensionnelle combine
deux types de migration conduits dans deux
dimensions perpendiculaires l’une à l’autre. La
première migration sépare les protéines natives de
l’échantillon selon leur pH isoélectrique (focalisation isoélectrique) et la seconde, leurs éventuels
polypeptides constitutifs, selon la taille, après
dénaturation par le SDS. De cette façon, les différents éléments d’un mélange sont répartis sur une
grande surface, ce qui augmente considérablement
la résolution de la séparation ;on peut ainsi discerner plus de 10 00 taches correspondant chacune à
un polypeptide (voir figure 3.4).
En raison de leur organisation moléculaire et de
leur charge négative, les acides nucléiques linéaires
sont directement séparables en fonction de leur
taille, par électrophorèse sur un gel poreux serré.
La technique récente d’électrophorèse en champ
pulsé permet la séparation de molécules d’ADN
de très grande taille, allant jusqu’à des chromosomes eucaryotiques entiers ;l es 16 chromosomes
de la levure de bière sont ainsi obtenus individuellement, préalable indispensable à leur cartographie et à leur séquençage complets (voir figure 3.5).
1.2.2. U LTRACENTRIFUGATION
La séparation de particules biologiques allant
des petites macromolécules (protéines) jusqu’aux
gros édifices supramoléculaires (ribosomes, Virus)
peut être obtenue par cette technique. En fonction
du protocole mis en œuvre, celle-ci conduit à séparer les particules selon : 1) pour l’essentiel, leur
taille et leur forme, ou 2) uniquement leur densité,
indépendamment de ces deux paramètres.
Les ultracentrifugeuses sont des machines très
sophistiquées par rapport aux centrifugeuses classiques ;l eurs rotors peuvent tourner jusqu’à près
de 80 000 tours par minute, et ils fournissent des
champs de gravité atteignant 500 000 fois la gravité terrestre. Dans ces conditions, et en utilisant la
technique dite de centrifugation en gradient,
Figure 3.4
Séparation de protéines dénaturées par électrophorèse
monodimensionnelle (à gauche) et bidimensionnelle
(à droite), sur gels de polyacrylamide
Dans le premier cas, chaque canal correspond à un
échantillon de protéines donné, tandis que dans le
second, un seul échantillon est traité et tous les polypeptides du mélange sont répartis sur l’ensemble du gel
(dont seule une partie est montrée ici). Les différentes
bandes ou spots sont visualisées par des colorants tels
que le bleu de Coomassie ou le nitrate d’argent. (Clichés
Labo BG et MVE, Orsay).
1 2 3
kb
9,4
6,6
4,4
2,3
2,0
kb
1900 /1 640
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680
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610
555
450
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295
225
Figure 3.5
Électrophorèses monodimensionnelles d’acides
nucléiques sur gels de polyacrylamide
À gauche, séparation d’échantillons d’ADNmt
d’Amphibiens digérés par des enzymes de restriction.
À droite, séparation des 16 chromosomes de la levure
par électrophorèse en champ pulsé.
La taille des différentes molécules d’ADN est indiquée
en kb. Noter la différence considérable de résolution que
permettent ces deux techniques (sens de la migration
indiqué par la flèche). (Clichés Labo BG, Orsay).