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B IOLOGIE CELLULAIRE
• La chromatographie sur colonne dite HPLC
(ou CLHP : chromatographie liquide à haute performance) est la plus récente parmi ces techniques.
Utilisant des supports poreux très finement divisés et fortement compressés, elle nécessite un fonctionnement à des pressions élevées pour que
l’écoulement soit suffisamment rapide. Bien
qu’exigeant un appareillage sophistiqué et coûteux, les possibilités considérables de sensibilité et
de résolution de l’HPLC en font une méthode analytique et préparative d’un grand intérêt. En outre,
elle permet aussi bien de séparer des petites molécules que des macromolécules.
•La chromatographie et l’électrophorèse sont
aussi des méthodes de séparation privilégiées des
macromolécules. Les protéines natives et fonctionnelles, extraites dans des conditions douces, sont
séparées en fonction de leur taille par tamisage
moléculaire sur un support constitué de microbilles poreuses (voir figure 3.2), ou bien en fonction
de leur charge électrique, par chromatographie sur
colonne échangeuse d’ions. La chromatographie
d’affinité est utilisée pour isoler les protéines susceptibles de lier un ligand spécifique ;dans ce cas,
le ligand purifié est chimiquement accroché au
support poreux de la colonne et il retient la seule
protéine en solution qui ait de l’affinité pour lui au
cours de l’élution du mélange de protéines initial.
Cette technique très puissante permet d’isoler des
protéines minoritaires difficiles à purifier autrement (voir figure 3.3).
• L’électrophorèse est une méthode de choix
pour séparer, en présence d’un champ électrique,
les centaines ou les milliers d’espèces moléculaires
de protéines et d’acides nucléiques constituant les
mélanges naturellement rencontrés dans les cellules. Dans le cas des protéines, on distingue l’électrophorèse des protéines natives de celle des
protéines dénaturées et séparées en leurs polypeptides constitutifs. La première méthode est réalisée
dans des conditions physicochimiques conservant
les propriétés biologiques des molécules (enzymatiques, par exemple). Elle nécessite un support
poreux lâche : papier, gel d’amidon, qui permet
leur séparation sur la base de leur charge électrique
(en fait, le rapport charge/masse) ;e lle permet la
réalisation de zymogrammes. La seconde méthode
implique l’utilisation de détergents ioniques forts
(SDS ; voir p. 122), et de composés réducteurs
( β -mercaptoéthanol), qui séparent et dénaturent
totalement les différents polypeptides formant les
protéines complexes. En se fixant aux polypeptides, le SDS leur confère une charge négative
Figure 3.2
Principe du tamisage moléculaire sur un support
de microbilles poreuses : chromatographie d’exclusion
Les molécules les plus petites (colorées) peuvent pénétrer au sein des microbilles, tandis que les plus grosses
en sont exclues et passent seulement entre elles. Au
cours de l’élution sur une colonne, la séparation des
deux catégories de molécules est due à la différence de
trajet parcouru, les plus petites étant les plus ralenties.
Figure 3.3
Principes de la chromatographie par échanges d’ions
et de la chromatographie d’affinité
À gauche, aspect schématique des microbilles portant
des groupements chimiques chargés positivement, auxquels les molécules de charge électrique opposée ont
tendance à se fixer ;c elles-ci seront ainsi retenues sur la
colonne.
À droite, aspect schématique des microbilles auxquelles
on a greffé un ligand approprié capable de fixer une
seule espèce moléculaire, qui sera ainsi retenue sur la
colonne.
Solvant
Mélange de
protéines placé
sur la colonne
Microbilles
poreuses
Disque poreux
Éluat
B IOLOGIE CELLULAIRE
• La chromatographie sur colonne dite HPLC
(ou CLHP : chromatographie liquide à haute performance) est la plus récente parmi ces techniques.
Utilisant des supports poreux très finement divisés et fortement compressés, elle nécessite un fonctionnement à des pressions élevées pour que
l’écoulement soit suffisamment rapide. Bien
qu’exigeant un appareillage sophistiqué et coûteux, les possibilités considérables de sensibilité et
de résolution de l’HPLC en font une méthode analytique et préparative d’un grand intérêt. En outre,
elle permet aussi bien de séparer des petites molécules que des macromolécules.
•La chromatographie et l’électrophorèse sont
aussi des méthodes de séparation privilégiées des
macromolécules. Les protéines natives et fonctionnelles, extraites dans des conditions douces, sont
séparées en fonction de leur taille par tamisage
moléculaire sur un support constitué de microbilles poreuses (voir figure 3.2), ou bien en fonction
de leur charge électrique, par chromatographie sur
colonne échangeuse d’ions. La chromatographie
d’affinité est utilisée pour isoler les protéines susceptibles de lier un ligand spécifique ;dans ce cas,
le ligand purifié est chimiquement accroché au
support poreux de la colonne et il retient la seule
protéine en solution qui ait de l’affinité pour lui au
cours de l’élution du mélange de protéines initial.
Cette technique très puissante permet d’isoler des
protéines minoritaires difficiles à purifier autrement (voir figure 3.3).
• L’électrophorèse est une méthode de choix
pour séparer, en présence d’un champ électrique,
les centaines ou les milliers d’espèces moléculaires
de protéines et d’acides nucléiques constituant les
mélanges naturellement rencontrés dans les cellules. Dans le cas des protéines, on distingue l’électrophorèse des protéines natives de celle des
protéines dénaturées et séparées en leurs polypeptides constitutifs. La première méthode est réalisée
dans des conditions physicochimiques conservant
les propriétés biologiques des molécules (enzymatiques, par exemple). Elle nécessite un support
poreux lâche : papier, gel d’amidon, qui permet
leur séparation sur la base de leur charge électrique
(en fait, le rapport charge/masse) ;e lle permet la
réalisation de zymogrammes. La seconde méthode
implique l’utilisation de détergents ioniques forts
(SDS ; voir p. 122), et de composés réducteurs
( β -mercaptoéthanol), qui séparent et dénaturent
totalement les différents polypeptides formant les
protéines complexes. En se fixant aux polypeptides, le SDS leur confère une charge négative
Figure 3.2
Principe du tamisage moléculaire sur un support
de microbilles poreuses : chromatographie d’exclusion
Les molécules les plus petites (colorées) peuvent pénétrer au sein des microbilles, tandis que les plus grosses
en sont exclues et passent seulement entre elles. Au
cours de l’élution sur une colonne, la séparation des
deux catégories de molécules est due à la différence de
trajet parcouru, les plus petites étant les plus ralenties.
Figure 3.3
Principes de la chromatographie par échanges d’ions
et de la chromatographie d’affinité
À gauche, aspect schématique des microbilles portant
des groupements chimiques chargés positivement, auxquels les molécules de charge électrique opposée ont
tendance à se fixer ;c elles-ci seront ainsi retenues sur la
colonne.
À droite, aspect schématique des microbilles auxquelles
on a greffé un ligand approprié capable de fixer une
seule espèce moléculaire, qui sera ainsi retenue sur la
colonne.
Solvant
Mélange de
protéines placé
sur la colonne
Microbilles
poreuses
Disque poreux
Éluat