3. A NALYSE DES CONSTITUANTS ET DU FONCTIONNEMENT DES CELLULES
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sation à chaud dans un solvant organique, tel que
le benzène ou l’éther, suivie d’une séparation des
deux phases.
Enfin, une méthode plus résolutive permet de
séparer aisément les macromolécules natives en
solution des composés de faible masse moléculaire
(sels minéraux ou précurseurs organiques), par
une opération dite de «filtration sur gel », ou
tamisage moléculaire (voir plus loin). Cette technique consiste en une «chromatographie» sur
colonne utilisant un gel poreux formé de microbilles de nature polysaccharidique ;i l s’agit d’une
filtration par exclusion car les plus grosses molécules sont éluées les premières et donc séparées
des autres.
1.2. Te chniques analytiques
en biochimie et biologie cellulaire
1.2.1. C HROMATOGRAPHIE ET ÉLECTROPHORÈSE
Les différentes espèces chimiques de faible
masse moléculaire appartenant au groupe des précurseurs peuvent être séparées les unes des autres
puis récupérées individuellement, grâce à trois
techniques majeures : les chromatographies de
partage et par échange d’ions, et l’électrophorèse.
Ces techniques utilisent respectivement les propriétés de solubilité différentielle des composés
dans des solvants ou des mélanges de solvants
variés (phase mobile), ou encore les différences de
charge électrique. Elles permettent aisément de
séparer les sucres simples, les acides aminés, les
acides organiques et les acides gras, les nucléotides… La mise en œuvre des diverses formes de
chromatographie nécessite l’emploi de supports
poreux (phase stationnaire) permettant le déplacement des molécules ;ceux-ci peuvent être soit une
simple feuille de papier filtre, soit une fine couche
de silice ou de cellulose coulée sur un support
plan (verre, plastique), soit une masse pulvérulente contenue dans une colonne de verre (chromatographie sur colonne).
• Dans le cas de supports plans, la méthode de
chromatographie de partage bidimensionnelle
est mise en œuvre et se pratique de la façon suivante:on procède d’abord à une première chromatographie, dans un premier système de
solvants et portant sur un seul échantillon (un seul
spot déposé latéralement, dans un coin du support). La plaque est ensuite séchée, tournée de 90°
et soumise à une deuxième migration dans un système de solvants différent du premier, donnant un
autre type de séparation. Après cette nouvelle
migration, les constituants du mélange sont répartis sur toute la surface de la plaque et donc mieux
séparés qu’après une migration monodimensionnelle (voir figure 3.1).
Figure 3.1
Chromatographie de partage bidimensionnelle
Un mélange d’acides aminés issus de l’hydrolyse d’une
protéine est séparé en deux dimensions grâce à l’utilisation de deux mélanges de solvants différents. La croix, en
haut et à gauche, représente le point de dépôt de l’échantillon analysé. Le résultat de la première chromatographie (monodimensionnelle) est représenté sous forme de
taches en pointillés de couleur situées à la verticale du
dépôt.
diagrammes de diffraction des rayons X. Il faudra attendre encore quinze ans pour avoir la
structure équivalente d’un ARNt.
1975 : perfectionnement des techniques d’électrophorèse des protéines et développement de
l’électrophorèse bidimensionnelle à haute résolution (O
’
F ARRELL).
1975-1977 : développement de techniques relativement simples permettant de séquencer rapidement de longs fragments d’ADN.
1984 : mise au point de l’électrophorèse en
champ pulsé permettant de séparer de très
grosses molécules d’ADN, y compris des chromosomes entiers (par exemple, ceux de la levure
de bière).
Solvant : collidine - eau
Solvant :phénol - NH
3
- eau
cystine ASP
GLU
SER
GLY
THR
ALA
TYR
VAL
LEU
PHE
PRO
ARG
HIST
LYS
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© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
sation à chaud dans un solvant organique, tel que
le benzène ou l’éther, suivie d’une séparation des
deux phases.
Enfin, une méthode plus résolutive permet de
séparer aisément les macromolécules natives en
solution des composés de faible masse moléculaire
(sels minéraux ou précurseurs organiques), par
une opération dite de «filtration sur gel », ou
tamisage moléculaire (voir plus loin). Cette technique consiste en une «chromatographie» sur
colonne utilisant un gel poreux formé de microbilles de nature polysaccharidique ;i l s’agit d’une
filtration par exclusion car les plus grosses molécules sont éluées les premières et donc séparées
des autres.
1.2. Te chniques analytiques
en biochimie et biologie cellulaire
1.2.1. C HROMATOGRAPHIE ET ÉLECTROPHORÈSE
Les différentes espèces chimiques de faible
masse moléculaire appartenant au groupe des précurseurs peuvent être séparées les unes des autres
puis récupérées individuellement, grâce à trois
techniques majeures : les chromatographies de
partage et par échange d’ions, et l’électrophorèse.
Ces techniques utilisent respectivement les propriétés de solubilité différentielle des composés
dans des solvants ou des mélanges de solvants
variés (phase mobile), ou encore les différences de
charge électrique. Elles permettent aisément de
séparer les sucres simples, les acides aminés, les
acides organiques et les acides gras, les nucléotides… La mise en œuvre des diverses formes de
chromatographie nécessite l’emploi de supports
poreux (phase stationnaire) permettant le déplacement des molécules ;ceux-ci peuvent être soit une
simple feuille de papier filtre, soit une fine couche
de silice ou de cellulose coulée sur un support
plan (verre, plastique), soit une masse pulvérulente contenue dans une colonne de verre (chromatographie sur colonne).
• Dans le cas de supports plans, la méthode de
chromatographie de partage bidimensionnelle
est mise en œuvre et se pratique de la façon suivante:on procède d’abord à une première chromatographie, dans un premier système de
solvants et portant sur un seul échantillon (un seul
spot déposé latéralement, dans un coin du support). La plaque est ensuite séchée, tournée de 90°
et soumise à une deuxième migration dans un système de solvants différent du premier, donnant un
autre type de séparation. Après cette nouvelle
migration, les constituants du mélange sont répartis sur toute la surface de la plaque et donc mieux
séparés qu’après une migration monodimensionnelle (voir figure 3.1).
Figure 3.1
Chromatographie de partage bidimensionnelle
Un mélange d’acides aminés issus de l’hydrolyse d’une
protéine est séparé en deux dimensions grâce à l’utilisation de deux mélanges de solvants différents. La croix, en
haut et à gauche, représente le point de dépôt de l’échantillon analysé. Le résultat de la première chromatographie (monodimensionnelle) est représenté sous forme de
taches en pointillés de couleur situées à la verticale du
dépôt.
diagrammes de diffraction des rayons X. Il faudra attendre encore quinze ans pour avoir la
structure équivalente d’un ARNt.
1975 : perfectionnement des techniques d’électrophorèse des protéines et développement de
l’électrophorèse bidimensionnelle à haute résolution (O
’
F ARRELL).
1975-1977 : développement de techniques relativement simples permettant de séquencer rapidement de longs fragments d’ADN.
1984 : mise au point de l’électrophorèse en
champ pulsé permettant de séparer de très
grosses molécules d’ADN, y compris des chromosomes entiers (par exemple, ceux de la levure
de bière).
Solvant : collidine - eau
Solvant :phénol - NH
3
- eau
cystine ASP
GLU
SER
GLY
THR
ALA
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LEU
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