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B IOLOGIE CELLULAIRE
1. MÉTHODES D’ANALYSE
DES CONSTITUANTS
CELLULAIRES
Ces méthodes d’analyse ont un double objectif :
1) établir, dans le cadre d’une recherche globale,
un catalogue des molécules constituant un échantillon biologique donné, indépendamment de leur
fonction, et 2) repérer dans une fraction, ou localiser dans une structure, une seule espèce moléculaire déjà connue, dans le cadre d’une approche
plus ciblée, fonctionnelle par exemple. L’encart
historique suivant donne les dates des principales
découvertes dans ce domaine.
1.1. Fractionnement chimique
Les techniques de séparation les plus anciennes
et aussi les plus brutales consistent, dans un premier temps, à séparer les petites molécules (organiques ou minérales) des macromolécules ;c es
dernières présentent des propriétés physicochimiques spécifiques qui sont utilisées à cet effet : on
parle alors de fractionnement chimique.
Lorsqu’un extrait biologique brut, tel qu’un homogénat, est traité par un acide fort à froid, les
macromolécules (en particulier, les protéines) sont
dénaturées et forment des précipités faciles à sédimenter par centrifugation. Le surnageant contient
tous les précurseurs organiques solubles dans
l’eau : acides aminés, glucides, nucléotides, produits de dégradation…, ainsi que les ions minéraux. La chaleur, les fortes concentrations salines,
certains composés chimiques ou solvants produisent des effets identiques.
Pour séparer les composés organiques, on utilise aussi leurs propriétés de solubilité différentielle, en fonction de la concentration saline, du pH
du milieu, ou de différents solvants… On peut
citer, par exemple, la précipitation par un alcool,
en présence d’un sel concentré, des acides
nucléiques en solution aqueuse. Dans ces conditions, ceux-ci sont neutralisés, deviennent moins
solubles et floculent ;o n les récupère ensuite par
centrifugation. Cette technique est très utilisée en
biologie moléculaire pour purifier rapidement les
ADN et les ARN. Les composés lipidiques hydrophobes (graisses, huiles, phospholipides) sont
séparés des composés hydrosolubles par solubiliPrincipales techniques analytiques
utilisées en biologie
1895-1912 : mise en évidence des rayons X par
R OENTGEN et développement des profils de diffraction des rayons X pour l’analyse de cristaux
minéraux.
1906 : invention par T SWETT de la chromatographie de partage sur colonne et séparation des
pigments d’un extrait organique de feuilles.
1925-1935 : S VEDBERG met au point et perfectionne la technique d’ultracentrifugation analytique pour déterminer les constantes de
sédimentation des protéines ;i l estime la masse
moléculaire de l’hémoglobine à 68 000 Da.
1930 : utilisation d’un isotope lourd (
15
N), fourni
sous forme d’acide aminé substitué, pour
démontrer le renouvellement très rapide de la
matière vivante (turn-over).
1933 : mise au point par T ISELIUS de l’électrophorèse en phase liquide pour la séparation des
protéines.
1934-1941 : présentation des premiers diagrammes de diffraction des rayons X de protéines cristallisées (pepsine) et d’ADN.
1938-1940 : utilisation des radio-isotopes
comme traceurs pour l’analyse du métabolisme
intermédiaire des glucides et des lipides.
1942-1944 : mise au point de la chromatographie de partage sur papier.
1946 : mise au point de la chromatographie sur
colonne d’amidon et sur résine échangeuse
d’ions.
1948 : H OGEBOOM, S CHNEIDER et P ALADE perfectionnent les méthodes de la centrifugation différentielle en vue du fractionnement cellulaire.
1953 : publication de la première séquence
d’acides aminés d’une protéine : l’insuline, par
S ANGER et son équipe, après dix ans de travail.
1955 : mise au point de l’électrophorèse sur gel
d’amidon pour la séparation des protéines.
1959 : mise au point des supports de polyacrylamide (gels) pour l’électrophorèse des protéines.
1960 : publication des premières structures
tridimensionnelles détaillées de protéines (myoglobine et hémoglobine) obtenues à partir de
E NCARTH ISTORIQUE
B IOLOGIE CELLULAIRE
1. MÉTHODES D’ANALYSE
DES CONSTITUANTS
CELLULAIRES
Ces méthodes d’analyse ont un double objectif :
1) établir, dans le cadre d’une recherche globale,
un catalogue des molécules constituant un échantillon biologique donné, indépendamment de leur
fonction, et 2) repérer dans une fraction, ou localiser dans une structure, une seule espèce moléculaire déjà connue, dans le cadre d’une approche
plus ciblée, fonctionnelle par exemple. L’encart
historique suivant donne les dates des principales
découvertes dans ce domaine.
1.1. Fractionnement chimique
Les techniques de séparation les plus anciennes
et aussi les plus brutales consistent, dans un premier temps, à séparer les petites molécules (organiques ou minérales) des macromolécules ;c es
dernières présentent des propriétés physicochimiques spécifiques qui sont utilisées à cet effet : on
parle alors de fractionnement chimique.
Lorsqu’un extrait biologique brut, tel qu’un homogénat, est traité par un acide fort à froid, les
macromolécules (en particulier, les protéines) sont
dénaturées et forment des précipités faciles à sédimenter par centrifugation. Le surnageant contient
tous les précurseurs organiques solubles dans
l’eau : acides aminés, glucides, nucléotides, produits de dégradation…, ainsi que les ions minéraux. La chaleur, les fortes concentrations salines,
certains composés chimiques ou solvants produisent des effets identiques.
Pour séparer les composés organiques, on utilise aussi leurs propriétés de solubilité différentielle, en fonction de la concentration saline, du pH
du milieu, ou de différents solvants… On peut
citer, par exemple, la précipitation par un alcool,
en présence d’un sel concentré, des acides
nucléiques en solution aqueuse. Dans ces conditions, ceux-ci sont neutralisés, deviennent moins
solubles et floculent ;o n les récupère ensuite par
centrifugation. Cette technique est très utilisée en
biologie moléculaire pour purifier rapidement les
ADN et les ARN. Les composés lipidiques hydrophobes (graisses, huiles, phospholipides) sont
séparés des composés hydrosolubles par solubiliPrincipales techniques analytiques
utilisées en biologie
1895-1912 : mise en évidence des rayons X par
R OENTGEN et développement des profils de diffraction des rayons X pour l’analyse de cristaux
minéraux.
1906 : invention par T SWETT de la chromatographie de partage sur colonne et séparation des
pigments d’un extrait organique de feuilles.
1925-1935 : S VEDBERG met au point et perfectionne la technique d’ultracentrifugation analytique pour déterminer les constantes de
sédimentation des protéines ;i l estime la masse
moléculaire de l’hémoglobine à 68 000 Da.
1930 : utilisation d’un isotope lourd (
15
N), fourni
sous forme d’acide aminé substitué, pour
démontrer le renouvellement très rapide de la
matière vivante (turn-over).
1933 : mise au point par T ISELIUS de l’électrophorèse en phase liquide pour la séparation des
protéines.
1934-1941 : présentation des premiers diagrammes de diffraction des rayons X de protéines cristallisées (pepsine) et d’ADN.
1938-1940 : utilisation des radio-isotopes
comme traceurs pour l’analyse du métabolisme
intermédiaire des glucides et des lipides.
1942-1944 : mise au point de la chromatographie de partage sur papier.
1946 : mise au point de la chromatographie sur
colonne d’amidon et sur résine échangeuse
d’ions.
1948 : H OGEBOOM, S CHNEIDER et P ALADE perfectionnent les méthodes de la centrifugation différentielle en vue du fractionnement cellulaire.
1953 : publication de la première séquence
d’acides aminés d’une protéine : l’insuline, par
S ANGER et son équipe, après dix ans de travail.
1955 : mise au point de l’électrophorèse sur gel
d’amidon pour la séparation des protéines.
1959 : mise au point des supports de polyacrylamide (gels) pour l’électrophorèse des protéines.
1960 : publication des premières structures
tridimensionnelles détaillées de protéines (myoglobine et hémoglobine) obtenues à partir de
E NCARTH ISTORIQUE