332 B IOLOGIE CELLULAIRE
sions. De plus, grâce à l’utilisation simultanée
d’anticorps distincts marqués par des fluorochromes différents, elle permet d’étudier les interrelations existant entre eux ou bien avec d’autres
structures ou organites. Depuis 1987, cette
approche s’est enrichie d’une nouvelle technique
cytologique, nommée microscopie confocale, qui
fournit des images d’une qualité exceptionnelle.
Celle-ci a connu un développement fulgurant car
elle complète remarquablement l’utilisation des
marqueurs fluorescents couplés aux protéines. Son
principe est exposé dans l’encart suivant.
1.2.2. D IFFÉRENTS RÉSEAUX
ET STRUCTURES VISUALISÉS
• Lorsque des anticorps anti-tubuline sont
appliqués à des cellules animales en culture fixées
et perméabilisées, on obtient des images telles que
celle de la figure 11.5. Le cytoplasme de ces cellules
est sillonné par une multitude de filaments lumineux, plus ou moins tortueux, représentant des
microtubules individuels ou très proches ; ceux-ci
sont particulièrement abondants à proximité du
noyau, qui se détache en sombre sur le cliché. Cet
aspect tient à deux raisons : d’une part, ces cellules
sont très aplaties sur leur support et la masse de
hyaloplasme contenant les microtubules est plus
abondante autour du noyau qu’à son niveau,
d’autre part c’est à proximité de ce dernier que se
situe l’unique foyer de nucléation de microtubules
présent dans ce type de cellules. On désigne, par
cette expression, toute structure capable de provoquer l’apparition (amorcer la synthèse) de nouveaux microtubules ; dans le cas présent, cette
structure est constituée par le centrosome, dont
l’organisation précise sera décrite plus tard.
La même technique, appliquée à des cellules
végétales différenciées telles que des cellules de
parenchyme foliaire, montre que les microtubules
se disposent en faisceaux corticaux parallèles et
serrés qui forment une hélice tournant tout autour
de la cellule. L’orientation de ces faisceaux est,
comme on l’a signalé plus haut, parallèle à celle
des fibres de cellulose de la paroi. Enfin, lorsqu’on
Figure 11.4
Principe de l’immunofluorescence indirecte
Comparer ce schéma à celui de la figure 3.8, présentant
l’immunofluorescence directe.
(1) Anticorps primaire ; (2) Anticorps secondaire.
Le microscope confocal
E NCARTT ECHNIQUE
Dans un microscope photonique banal, la lumière
traverse complètement l’objet observé et chaque
plan illuminé de celui-ci interfère, au niveau du
signal reçu par l’œil, avec tous ceux situés audessus et au-dessous ; quand il s’agit d’objets
d’épaisseur supérieure à 5 µ m, ceci conduit à un
brouillage important de l’image. Le microscope
confocal comporte un dispositif d’éclairage par
un fin faisceau laser focalisé, à travers l’objectif,
sur un seul point de l’objet. Ce point, vivement
éclairé, réémet une lumière qui traverse à son
tour l’objectif et est captée par un système de
photomultiplicateurs ; ceux-ci amplifient le signal
qui est enregistré sur un système vidéo. L’utilisation d’un diaphragme très fin à l’entrée des photomultiplicateurs permet de ne capter que les
rayons lumineux provenant du seul point éclairé
de l’objet. Le faisceau, qui a donc la forme d’un
cône lumineux très pointu, balaie le plan de l’objet
point par point et procède par plans successifs
distants de 0,1 à 1 µ m dans le sens de l’épaisseur
de l’objet. L’avantage considérable de ce système
est qu’il permet de réaliser artificiellement des
coupes optiques et d’étudier des objets transparents épais, en les analysant optiquement plan
après plan. Son association avec des systèmes
informatiques sophistiqués permet d’exploiter de
façon très complète les images enregistrées : analyses quantitatives, stéréoscopie, reconstitutions
en trois dimensions, fausses couleurs.
2
1
sions. De plus, grâce à l’utilisation simultanée
d’anticorps distincts marqués par des fluorochromes différents, elle permet d’étudier les interrelations existant entre eux ou bien avec d’autres
structures ou organites. Depuis 1987, cette
approche s’est enrichie d’une nouvelle technique
cytologique, nommée microscopie confocale, qui
fournit des images d’une qualité exceptionnelle.
Celle-ci a connu un développement fulgurant car
elle complète remarquablement l’utilisation des
marqueurs fluorescents couplés aux protéines. Son
principe est exposé dans l’encart suivant.
1.2.2. D IFFÉRENTS RÉSEAUX
ET STRUCTURES VISUALISÉS
• Lorsque des anticorps anti-tubuline sont
appliqués à des cellules animales en culture fixées
et perméabilisées, on obtient des images telles que
celle de la figure 11.5. Le cytoplasme de ces cellules
est sillonné par une multitude de filaments lumineux, plus ou moins tortueux, représentant des
microtubules individuels ou très proches ; ceux-ci
sont particulièrement abondants à proximité du
noyau, qui se détache en sombre sur le cliché. Cet
aspect tient à deux raisons : d’une part, ces cellules
sont très aplaties sur leur support et la masse de
hyaloplasme contenant les microtubules est plus
abondante autour du noyau qu’à son niveau,
d’autre part c’est à proximité de ce dernier que se
situe l’unique foyer de nucléation de microtubules
présent dans ce type de cellules. On désigne, par
cette expression, toute structure capable de provoquer l’apparition (amorcer la synthèse) de nouveaux microtubules ; dans le cas présent, cette
structure est constituée par le centrosome, dont
l’organisation précise sera décrite plus tard.
La même technique, appliquée à des cellules
végétales différenciées telles que des cellules de
parenchyme foliaire, montre que les microtubules
se disposent en faisceaux corticaux parallèles et
serrés qui forment une hélice tournant tout autour
de la cellule. L’orientation de ces faisceaux est,
comme on l’a signalé plus haut, parallèle à celle
des fibres de cellulose de la paroi. Enfin, lorsqu’on
Figure 11.4
Principe de l’immunofluorescence indirecte
Comparer ce schéma à celui de la figure 3.8, présentant
l’immunofluorescence directe.
(1) Anticorps primaire ; (2) Anticorps secondaire.
Le microscope confocal
E NCARTT ECHNIQUE
Dans un microscope photonique banal, la lumière
traverse complètement l’objet observé et chaque
plan illuminé de celui-ci interfère, au niveau du
signal reçu par l’œil, avec tous ceux situés audessus et au-dessous ; quand il s’agit d’objets
d’épaisseur supérieure à 5 µ m, ceci conduit à un
brouillage important de l’image. Le microscope
confocal comporte un dispositif d’éclairage par
un fin faisceau laser focalisé, à travers l’objectif,
sur un seul point de l’objet. Ce point, vivement
éclairé, réémet une lumière qui traverse à son
tour l’objectif et est captée par un système de
photomultiplicateurs ; ceux-ci amplifient le signal
qui est enregistré sur un système vidéo. L’utilisation d’un diaphragme très fin à l’entrée des photomultiplicateurs permet de ne capter que les
rayons lumineux provenant du seul point éclairé
de l’objet. Le faisceau, qui a donc la forme d’un
cône lumineux très pointu, balaie le plan de l’objet
point par point et procède par plans successifs
distants de 0,1 à 1 µ m dans le sens de l’épaisseur
de l’objet. L’avantage considérable de ce système
est qu’il permet de réaliser artificiellement des
coupes optiques et d’étudier des objets transparents épais, en les analysant optiquement plan
après plan. Son association avec des systèmes
informatiques sophistiqués permet d’exploiter de
façon très complète les images enregistrées : analyses quantitatives, stéréoscopie, reconstitutions
en trois dimensions, fausses couleurs.
2
1