11. A RCHITECTURE ET MOTILITÉ CELLULAIRES 331
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
nique quand il s’agit d’étudier des structures à
grande échelle. C’est le cas ici, car nous avons
affaire à des structures tubulaires ou fibreuses,
organisées le plus souvent en édifices de grande
taille emplissant toute la cellule. La finesse extrême
des coupes utilisées dans cette approche conduit à
une vision très partielle des objets, faisant alors
perdre la notion de volume. Ainsi, bien que toutes
les structures cytosquelettiques élémentaires fussent connues dans le plus grand détail dès le début
des années 70, la notion de cytosquelette elle-même
n’était pas encore établie. Il fallut attendre le perfectionnement d’une technique déjà ancienne :
l’immunofluorescence, et la purification des molécules constitutives du cytosquelette, grâce aux
techniques biochimiques, pour que les observations
permettent de dégager ce nouveau concept, vers la
fin de la décennie. Celui-ci a totalement renouvelé,
voire révolutionné, notre façon de comprendre la
cellule eucaryotique.
1.2. Données de la microscopie photonique
1.2.1. I MMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE
ET MICROSCOPIE CONFOCALE
L’immunofluorescence implique que les protéines majeures constituant les structures à observer aient préalablemement été purifiées par les
techniques biochimiques ; la tubuline, l’actine et les
protéines des microfilaments, qui sont à la base
des réseaux décrits plus haut, seront étudiées en
détail dans les lignes suivantes. L’immunofluorescence indirecte dérive de la technique d’immunofluorescence directe décrite dans le chapitre 3.
Cette méthode est basée sur le principe suivant :
l’anticorps primaire fabriqué contre la molécule que
l’on cherche à visualiser n’est pas lui-même rendu
fluorescent par couplage à un fluorochrome ; il est
en fait reconnu par un deuxième type d’anticorps,
dit secondaire, fabriqué «contre» le premier. Les
immunoglobulines d’un Mammifère comme la souris sont reconnues comme des antigènes par un
autre Mammifère tel que le lapin, par exemple,
contre lesquels celui-ci fabrique des anticorps antiimmunoglobulines de souris. Ce sont ces dernières
molécules purifiées qui seront marquées et détectées au microscope. Le protocole est le suivant :
l’anticorps primaire est lié à sa cible et l’anticorps
secondaire fluorescent est ensuite accroché à lui ;
comme toutes les reconnaissances sont très spécifiques au sein de cet édifice, la fluorescence est
émise au niveau de la cible primaire seule (voir
figure 11.4). Les avantages de la technique sont
considérables : 1) on amplifie beaucoup le signal
émis car plusieurs molécules d’anticorps secondaires sont fixées sur une seule molécule d’anticorps primaire, 2) les anticorps primaires sont rares
et précieux, car ils résultent souvent de longues et
coûteuses expériences, tandis que les anticorps
secondaires sont vendus dans le commerce, déjà
couplés à des fluorochromes. Cette technique est
donc plus sensible que la précédente et n’exige
que de faibles quantités d’anticorps primaires.
Son apport est capital dans l’analyse du cytosquelette car, appliquée à des cellules entières, elle
permet de visualiser les réseaux en trois dimenFigure 11.3
Filaments intermédiaires observés
en microscopie électronique
(a) cellule épithéliale en culture : coupe longitudinale
d’un faisceau de tonofilaments de kératine ; (b) et
(c) coupes d’axones (Ax) myélinisés montrant de nombreux neurofilaments et quelques microtubules (flèches).
Clichés Labo BC4 et Labo. BG, Orsay.
a
c
b
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
nique quand il s’agit d’étudier des structures à
grande échelle. C’est le cas ici, car nous avons
affaire à des structures tubulaires ou fibreuses,
organisées le plus souvent en édifices de grande
taille emplissant toute la cellule. La finesse extrême
des coupes utilisées dans cette approche conduit à
une vision très partielle des objets, faisant alors
perdre la notion de volume. Ainsi, bien que toutes
les structures cytosquelettiques élémentaires fussent connues dans le plus grand détail dès le début
des années 70, la notion de cytosquelette elle-même
n’était pas encore établie. Il fallut attendre le perfectionnement d’une technique déjà ancienne :
l’immunofluorescence, et la purification des molécules constitutives du cytosquelette, grâce aux
techniques biochimiques, pour que les observations
permettent de dégager ce nouveau concept, vers la
fin de la décennie. Celui-ci a totalement renouvelé,
voire révolutionné, notre façon de comprendre la
cellule eucaryotique.
1.2. Données de la microscopie photonique
1.2.1. I MMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE
ET MICROSCOPIE CONFOCALE
L’immunofluorescence implique que les protéines majeures constituant les structures à observer aient préalablemement été purifiées par les
techniques biochimiques ; la tubuline, l’actine et les
protéines des microfilaments, qui sont à la base
des réseaux décrits plus haut, seront étudiées en
détail dans les lignes suivantes. L’immunofluorescence indirecte dérive de la technique d’immunofluorescence directe décrite dans le chapitre 3.
Cette méthode est basée sur le principe suivant :
l’anticorps primaire fabriqué contre la molécule que
l’on cherche à visualiser n’est pas lui-même rendu
fluorescent par couplage à un fluorochrome ; il est
en fait reconnu par un deuxième type d’anticorps,
dit secondaire, fabriqué «contre» le premier. Les
immunoglobulines d’un Mammifère comme la souris sont reconnues comme des antigènes par un
autre Mammifère tel que le lapin, par exemple,
contre lesquels celui-ci fabrique des anticorps antiimmunoglobulines de souris. Ce sont ces dernières
molécules purifiées qui seront marquées et détectées au microscope. Le protocole est le suivant :
l’anticorps primaire est lié à sa cible et l’anticorps
secondaire fluorescent est ensuite accroché à lui ;
comme toutes les reconnaissances sont très spécifiques au sein de cet édifice, la fluorescence est
émise au niveau de la cible primaire seule (voir
figure 11.4). Les avantages de la technique sont
considérables : 1) on amplifie beaucoup le signal
émis car plusieurs molécules d’anticorps secondaires sont fixées sur une seule molécule d’anticorps primaire, 2) les anticorps primaires sont rares
et précieux, car ils résultent souvent de longues et
coûteuses expériences, tandis que les anticorps
secondaires sont vendus dans le commerce, déjà
couplés à des fluorochromes. Cette technique est
donc plus sensible que la précédente et n’exige
que de faibles quantités d’anticorps primaires.
Son apport est capital dans l’analyse du cytosquelette car, appliquée à des cellules entières, elle
permet de visualiser les réseaux en trois dimenFigure 11.3
Filaments intermédiaires observés
en microscopie électronique
(a) cellule épithéliale en culture : coupe longitudinale
d’un faisceau de tonofilaments de kératine ; (b) et
(c) coupes d’axones (Ax) myélinisés montrant de nombreux neurofilaments et quelques microtubules (flèches).
Clichés Labo BC4 et Labo. BG, Orsay.
a
c
b