300 B IOLOGIE CELLULAIRE
une protéine de la membrane interne de la mitochondrie : la succinate-déshydrogénase. L’encart
suivant décrit une technique classique de cytoenzymologie permettant de visualiser simplement
l’activité de cette enzyme.
Du point de vue énergétique, le cycle de Krebs
est directement à l’origine d’une seule molécule
riche en énergie par tour : une molécule de GTP,
équivalente à un ATP. Celle-ci est formée par une
décarboxylation oxydative mettant en jeu le CoA,
et qui est une réaction très voisine dans son mécanisme de celle qui conduit à la formation de l’acétyl-CoA. On doit donc retenir que le cycle de Krebs
n’est pas principalement en soi un système générateur d’énergie, mais un système fournissant des
coenzymes réduits qui, eux, seront réoxydés et à
l’origine d’une synthèse ultérieure abondante
d’ATP. L’énergie libre, contenue initialement dans
le glucose et récupérée lors des réactions d’oxydoréduction successives, est donc ainsi provisoirement stockée sous la forme de ce qu’on appelle
habituellement le pouvoir réducteur, constitué par
NADH + H
+
et FADH 2 .
Du point de vue métabolique, on note que le
cycle de Krebs met en jeu des acides organiques
comportant successivement six, cinq et quatre carbones. Nous avons déjà annoncé que certains
d’entre eux servent aussi de relais avec le métabolisme dégradatif des aliments autres que les sucres,
ou avec le métabolisme de synthèse de nombreux
précurseurs (voir chapitre 7). Il faut bien comprendre que : 1) ce cycle n’est pas isolé abstraitement dans la mitochondrie, comme on le fait sur
les schémas, 2) chaque tour de cycle commencé au
niveau du citrate ne se termine pas forcément, et
3) on peut, en contrepartie, entrer dans le cycle à
différents niveaux autres que le citrate. Nous étudierons ceci dans un développement réservé à
l’analyse de l’intégration du métabolisme.
2.3. Transport des électrons le long
de la chaîne des transporteurs
membranaires (chaîne respiratoire)
2.3.1. N OTION DE CHAÎNE DE TRANSPORTEURS
Les transporteurs réduits au cours du cycle de
Krebs cèdent leurs électrons à l’O 2 à la fin d’une
longue cascade de réactions d’oxydoréduction
mettant en jeu des constituants de la membrane
mitochondriale interne. Celle-ci est très riche en
protéines, parmi lesquelles on compte de nombreuses déshydrogénases ou transporteurs d’électrons à groupements prosthétiques divers :
déshydrogénases flavoprotéiques (à FAD ou
FMN), cytochromes variés (protéines à hème) et
Mise en évidence de l’activité
succinate-déshydrogénase
dans les mitochondries de cellules vivantes
Cette enzyme catalyse la réaction suivante :
succinate + coenzyme oxydé (FAD) → fumarate
+ coenzyme réduit (FADH 2 )
Aucune des molécules produites dans ce système ne remplit les conditions requises dans la
technique cytoenzymologique, relativement à la
couleur et l’insolubilité (voir chapitre 3). On
couple donc cette réaction à une autre, non biologique et spontanée, mettant en jeu un composé qui est soluble et de couleur jaune pâle à
l’état oxydé, et insoluble et formant un précipité
de couleur bleu-violacé à l’état réduit (nitrobleu de tétrazolium). On a donc la réaction :
FADH 2 + composé oxydé jaune →
FAD + composé réduit bleu-violacé
Le produit final des deux réactions couplées
s’accumule donc sur le lieu de la réaction catalysée par la succinate-déshydrogénase, c’est-àdire au sein des mitochondries.
Expérimentalement, on choisit des cellules
vivantes qui se prêtent à ce genre d’études : cellules isolées (Protistes), épithéliums animaux ou
végétaux, tissus faciles à écraser et dans lesquels les organites sont faciles à voir. Celles-ci
sont incubées dans une solution tamponnée de
succinate de Na et de sel de tétrazolium oxydé à
faibles concentrations (pour éviter la toxicité).
Une coloration violette apparaît au niveau de
structures cellulaires visibles au microscope et
qui sont les mitochondries. Cette réaction se
réalise aussi in vitro, sur des fractions purifiées
de ces organites. Divers contrôles sont nécessaires pour démontrer que seule cette réaction
est mise en évidence, en particulier l’utilisation
d’un inhibiteur compétitif très spécifique de
l’enzyme : le malonate (de structure très proche
de celle du succinate). Cette coloration vitale
conduit néanmoins à terme à la mort de la cellule en raison de l’accumulation irréversible du
composé réduit dans les mitochondries.
E NCARTT ECHNIQUE
une protéine de la membrane interne de la mitochondrie : la succinate-déshydrogénase. L’encart
suivant décrit une technique classique de cytoenzymologie permettant de visualiser simplement
l’activité de cette enzyme.
Du point de vue énergétique, le cycle de Krebs
est directement à l’origine d’une seule molécule
riche en énergie par tour : une molécule de GTP,
équivalente à un ATP. Celle-ci est formée par une
décarboxylation oxydative mettant en jeu le CoA,
et qui est une réaction très voisine dans son mécanisme de celle qui conduit à la formation de l’acétyl-CoA. On doit donc retenir que le cycle de Krebs
n’est pas principalement en soi un système générateur d’énergie, mais un système fournissant des
coenzymes réduits qui, eux, seront réoxydés et à
l’origine d’une synthèse ultérieure abondante
d’ATP. L’énergie libre, contenue initialement dans
le glucose et récupérée lors des réactions d’oxydoréduction successives, est donc ainsi provisoirement stockée sous la forme de ce qu’on appelle
habituellement le pouvoir réducteur, constitué par
NADH + H
+
et FADH 2 .
Du point de vue métabolique, on note que le
cycle de Krebs met en jeu des acides organiques
comportant successivement six, cinq et quatre carbones. Nous avons déjà annoncé que certains
d’entre eux servent aussi de relais avec le métabolisme dégradatif des aliments autres que les sucres,
ou avec le métabolisme de synthèse de nombreux
précurseurs (voir chapitre 7). Il faut bien comprendre que : 1) ce cycle n’est pas isolé abstraitement dans la mitochondrie, comme on le fait sur
les schémas, 2) chaque tour de cycle commencé au
niveau du citrate ne se termine pas forcément, et
3) on peut, en contrepartie, entrer dans le cycle à
différents niveaux autres que le citrate. Nous étudierons ceci dans un développement réservé à
l’analyse de l’intégration du métabolisme.
2.3. Transport des électrons le long
de la chaîne des transporteurs
membranaires (chaîne respiratoire)
2.3.1. N OTION DE CHAÎNE DE TRANSPORTEURS
Les transporteurs réduits au cours du cycle de
Krebs cèdent leurs électrons à l’O 2 à la fin d’une
longue cascade de réactions d’oxydoréduction
mettant en jeu des constituants de la membrane
mitochondriale interne. Celle-ci est très riche en
protéines, parmi lesquelles on compte de nombreuses déshydrogénases ou transporteurs d’électrons à groupements prosthétiques divers :
déshydrogénases flavoprotéiques (à FAD ou
FMN), cytochromes variés (protéines à hème) et
Mise en évidence de l’activité
succinate-déshydrogénase
dans les mitochondries de cellules vivantes
Cette enzyme catalyse la réaction suivante :
succinate + coenzyme oxydé (FAD) → fumarate
+ coenzyme réduit (FADH 2 )
Aucune des molécules produites dans ce système ne remplit les conditions requises dans la
technique cytoenzymologique, relativement à la
couleur et l’insolubilité (voir chapitre 3). On
couple donc cette réaction à une autre, non biologique et spontanée, mettant en jeu un composé qui est soluble et de couleur jaune pâle à
l’état oxydé, et insoluble et formant un précipité
de couleur bleu-violacé à l’état réduit (nitrobleu de tétrazolium). On a donc la réaction :
FADH 2 + composé oxydé jaune →
FAD + composé réduit bleu-violacé
Le produit final des deux réactions couplées
s’accumule donc sur le lieu de la réaction catalysée par la succinate-déshydrogénase, c’est-àdire au sein des mitochondries.
Expérimentalement, on choisit des cellules
vivantes qui se prêtent à ce genre d’études : cellules isolées (Protistes), épithéliums animaux ou
végétaux, tissus faciles à écraser et dans lesquels les organites sont faciles à voir. Celles-ci
sont incubées dans une solution tamponnée de
succinate de Na et de sel de tétrazolium oxydé à
faibles concentrations (pour éviter la toxicité).
Une coloration violette apparaît au niveau de
structures cellulaires visibles au microscope et
qui sont les mitochondries. Cette réaction se
réalise aussi in vitro, sur des fractions purifiées
de ces organites. Divers contrôles sont nécessaires pour démontrer que seule cette réaction
est mise en évidence, en particulier l’utilisation
d’un inhibiteur compétitif très spécifique de
l’enzyme : le malonate (de structure très proche
de celle du succinate). Cette coloration vitale
conduit néanmoins à terme à la mort de la cellule en raison de l’accumulation irréversible du
composé réduit dans les mitochondries.
E NCARTT ECHNIQUE