6. É CHANGES DE MATIÈ RE ENTRE CELLULE ET MILIEU EXTÉRIEUR.L ER Ô LE DE LA MEMBRANE PLASMIQUE 141
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
ont permis d’obtenir un tel résultat ? On connaît
des réactifs qui ne franchissent pas les bicouches et
qui se fixent spécifiquement sur certains groupements chimiques des lipides, ou bien les
détruisent ; ceci permet donc de marquer et/ou
repérer exclusivement ceux qui sont exposés sur la
face externe de la membrane plasmique.
Si l’on incube, par exemple, des hématies dans
le composé nommé FMMP (formyl méthiolnyl sulfone méthyl-phosphate, spécifique des fonctions -
NH 2 ), on observe, après purification des lipides
membranaires, que la phosphatidyl-sérine et la
phosphatidyl-éthanolamine, qui devraient normalement réagir avec lui, ne sont pas marquées. En
revanche, si la membrane plasmique est rendue
perméable au réactif grâce à un détergent, on
constate que ces deux lipides sont marqués ; ceci
démontre clairement qu’ils sont localisés dans la
couche interne de la bicouche. Par ailleurs, si on
incube des hématies en présence de phospholipases, enzymes qui attaquent uniquement les phospholipides accessibles de l’extérieur (les
protéines ne franchissant pas spontanément les
membranes), la phosphatidyl-choline et la sphingomyéline sont presque totalement dégradées, ce
qui indique leur présence quasi exclusive dans la
couche externe de la membrane (voir chapitre 5).
Cette asymétrie de la composition des membranes
due aux lipides a été retrouvée dans les membranes
plasmiques de très nombreux types cellulaires.
La question de l’asymétrie membranaire due
aux protéines a été traitée dans le chapitre 5. On
peut ajouter que la topologie des protéines est
aussi étudiée à l’aide d’anticorps anti-peptides,
utilisés sur des cellules perméabilisées ou non ;
cette méthode suppose que la séquence des protéines soit connue. Nous rappelons enfin l’existence de la technique permettant d’obtenir des
vésicules retournées à partir des membranes
d’hématies humaines. La mise en place initiale de
cette double polarité biochimique de la membrane
cytoplasmique sera traitée dans le chapitre 9.
1.2.2. F LUIDITÉ MEMBRANAIRE
La diffusion latérale des protéines dans la membrane plasmique a été démontrée in vivo, de façon
très élégante, dès le début des années 70, sur un
système biologique original qui mérite une description détaillée. On rappelle que c’est ce type
d’expériences qui a conduit à la notion désormais
classique de «mosaïque fluide ».
La possibilité de réaliser in vitro des hétérocaryons, à partir de cellules humaines et de cellules
de souris en culture (voir chapitre 3), a constitué
un outil idéal pour démontrer, par immunofluorescence, la diffusion latérale des protéines de la
surface cellulaire (voir figure 6.2). Après purification des protéines des membranes plasmiques des
deux types cellulaires, des anticorps spécifiques
sont fabriqués contre elles. Les anticorps anti-protéines humaines sont marqués par la rhodamine et
ceux dirigés contre les protéines de souris le sont
par la fluorescéine. Ces deux fluorochromes ont
été choisis car ils émettent une lumière différente
(respectivement rouge et verte) lorsqu’on les excite
avec deux longueurs d’onde appropriées. Dès que
les hétérocaryons sont obtenus ( t = 0), on introduit
dans le milieu de culture un mélange des deux
anticorps marqués et on observe leur distribution
sur ces cellules, grâce à la fluorescence qu’ils émettent (voir chapitre 3). Au temps 0, les deux anticorps sont situés chacun sur une moitié de
l’hétérocaryon, correspondant visiblement aux
deux cellules ayant fusionné. À mesure que le
temps passe, on constate que la fluorescence rouge
envahit progressivement la moitié «souris» de
l’hétérocaryon, et réciproquement pour la fluorescence verte. Au bout de 40 minutes, les deux couleurs (et donc les anticorps) sont complètement
mélangées, indiquant que leurs supports physiques, c’est-à-dire les protéines de surface, se sont
aussi mélangés. La vitesse du processus est élevée,
et donc la fluidité importante, puisque les protéines se sont déplacées de plusieurs dizaines de
µ m pendant le temps de l’expérience.
2. PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE.
TRANSPORTEURS
MEMBRANAIRES
2.1. Généralités. Mécanisme de la diffusion
Les mouvements d’ions ou de molécules à travers les membranes, chez les êtres vivants, sont
régis par des mécanismes spécifiques, mais ils
obéissent d’abord, bien évidemment, aux lois fondamentales de la physique. La première d’entre
elles est celle de la diffusion, qu’il faudra prendre
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit.
ont permis d’obtenir un tel résultat ? On connaît
des réactifs qui ne franchissent pas les bicouches et
qui se fixent spécifiquement sur certains groupements chimiques des lipides, ou bien les
détruisent ; ceci permet donc de marquer et/ou
repérer exclusivement ceux qui sont exposés sur la
face externe de la membrane plasmique.
Si l’on incube, par exemple, des hématies dans
le composé nommé FMMP (formyl méthiolnyl sulfone méthyl-phosphate, spécifique des fonctions -
NH 2 ), on observe, après purification des lipides
membranaires, que la phosphatidyl-sérine et la
phosphatidyl-éthanolamine, qui devraient normalement réagir avec lui, ne sont pas marquées. En
revanche, si la membrane plasmique est rendue
perméable au réactif grâce à un détergent, on
constate que ces deux lipides sont marqués ; ceci
démontre clairement qu’ils sont localisés dans la
couche interne de la bicouche. Par ailleurs, si on
incube des hématies en présence de phospholipases, enzymes qui attaquent uniquement les phospholipides accessibles de l’extérieur (les
protéines ne franchissant pas spontanément les
membranes), la phosphatidyl-choline et la sphingomyéline sont presque totalement dégradées, ce
qui indique leur présence quasi exclusive dans la
couche externe de la membrane (voir chapitre 5).
Cette asymétrie de la composition des membranes
due aux lipides a été retrouvée dans les membranes
plasmiques de très nombreux types cellulaires.
La question de l’asymétrie membranaire due
aux protéines a été traitée dans le chapitre 5. On
peut ajouter que la topologie des protéines est
aussi étudiée à l’aide d’anticorps anti-peptides,
utilisés sur des cellules perméabilisées ou non ;
cette méthode suppose que la séquence des protéines soit connue. Nous rappelons enfin l’existence de la technique permettant d’obtenir des
vésicules retournées à partir des membranes
d’hématies humaines. La mise en place initiale de
cette double polarité biochimique de la membrane
cytoplasmique sera traitée dans le chapitre 9.
1.2.2. F LUIDITÉ MEMBRANAIRE
La diffusion latérale des protéines dans la membrane plasmique a été démontrée in vivo, de façon
très élégante, dès le début des années 70, sur un
système biologique original qui mérite une description détaillée. On rappelle que c’est ce type
d’expériences qui a conduit à la notion désormais
classique de «mosaïque fluide ».
La possibilité de réaliser in vitro des hétérocaryons, à partir de cellules humaines et de cellules
de souris en culture (voir chapitre 3), a constitué
un outil idéal pour démontrer, par immunofluorescence, la diffusion latérale des protéines de la
surface cellulaire (voir figure 6.2). Après purification des protéines des membranes plasmiques des
deux types cellulaires, des anticorps spécifiques
sont fabriqués contre elles. Les anticorps anti-protéines humaines sont marqués par la rhodamine et
ceux dirigés contre les protéines de souris le sont
par la fluorescéine. Ces deux fluorochromes ont
été choisis car ils émettent une lumière différente
(respectivement rouge et verte) lorsqu’on les excite
avec deux longueurs d’onde appropriées. Dès que
les hétérocaryons sont obtenus ( t = 0), on introduit
dans le milieu de culture un mélange des deux
anticorps marqués et on observe leur distribution
sur ces cellules, grâce à la fluorescence qu’ils émettent (voir chapitre 3). Au temps 0, les deux anticorps sont situés chacun sur une moitié de
l’hétérocaryon, correspondant visiblement aux
deux cellules ayant fusionné. À mesure que le
temps passe, on constate que la fluorescence rouge
envahit progressivement la moitié «souris» de
l’hétérocaryon, et réciproquement pour la fluorescence verte. Au bout de 40 minutes, les deux couleurs (et donc les anticorps) sont complètement
mélangées, indiquant que leurs supports physiques, c’est-à-dire les protéines de surface, se sont
aussi mélangés. La vitesse du processus est élevée,
et donc la fluidité importante, puisque les protéines se sont déplacées de plusieurs dizaines de
µ m pendant le temps de l’expérience.
2. PERMÉABILITÉ MEMBRANAIRE.
TRANSPORTEURS
MEMBRANAIRES
2.1. Généralités. Mécanisme de la diffusion
Les mouvements d’ions ou de molécules à travers les membranes, chez les êtres vivants, sont
régis par des mécanismes spécifiques, mais ils
obéissent d’abord, bien évidemment, aux lois fondamentales de la physique. La première d’entre
elles est celle de la diffusion, qu’il faudra prendre