2 • Chromatographie liquide haute performance
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L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de la substance à condition
que celle-ci reste faible. Les détecteurs de fluorescence (fig. 2.24) à la fois sensibles et
sélectifs sont utilisables pour les composés naturellement fluorescents et pour tous ceux qui
peuvent le devenir par traitement préalable à la détection. Dans ce dernier cas on fait appel
aux procédés de dérivation pré- ou post-colonne : un automate placé soit avant la colonne
soit entre la colonne et le détecteur effectue une ou plusieurs réactions sur les composés afin
de les rendre fluorescents.
En suivant ce principe, on dose les traces de carbamates (pesticides) dans l’environnement, par saponification avec de la soude puis réaction sur l’aldéhyde o-phtalique, pour
transformer la méthylamine en un dérivé fluorescent (fig. 2.24 ).
H
H
O
O
RNH 2
OPA
HS–(CH HS–(CH 2 ) 2 –OH –OH
N R
S-(CH 2 ) 2 -OH
Int. fluorescence
radiation excitatrice
cellule de fluorescence
microcellule à circulation
1 -
2 -
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1 -
2 - pyrène
3 - benz(a) anthracène
4 - chrysène
5 - benzo(b) fluoranthène
6 - benzo(k) fluoranthène
7 - benzo(a) pyrène
8 - dibenzo(a,h) anthracène
9 - benzo(g,h,i) pérylène
10 - indéno(1,2,3cd) pyrène
repère temps mort
15 min
Mélange d'hydrocarbures
aromatiques (HPA)
excitation 280 nm
émission 390 nm
détecteur à fluorescence
Figure 2.24 Détection fluorimétrique.
Exemple de réactifs utilisés pour rendre fluorescentes les amines primaires par action
de l’OPA en présence de monothioglycol. Détail d’une cellule à circulation pour détecter la fluorescence. Dans la pratique, la fluorescence est observée dans une direction
perpendiculaire à la direction de l’excitation (reproduit avec l’autorisation de la société
Hewlett-Packard). Chromatogramme d’un mélange de quelques hydrocarbures polynucléaires aromatiques (HPA). L’intensité de fluorescence varie énormément d’un composé
à un autre, à la fois parce que la longueur d’onde d’excitation devrait être ajustée pour
chaque composé et que l’intensité de fluorescence varie également. Il existe des détecteurs programmables pour obtenir une réponse optimale.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de la substance à condition
que celle-ci reste faible. Les détecteurs de fluorescence (fig. 2.24) à la fois sensibles et
sélectifs sont utilisables pour les composés naturellement fluorescents et pour tous ceux qui
peuvent le devenir par traitement préalable à la détection. Dans ce dernier cas on fait appel
aux procédés de dérivation pré- ou post-colonne : un automate placé soit avant la colonne
soit entre la colonne et le détecteur effectue une ou plusieurs réactions sur les composés afin
de les rendre fluorescents.
En suivant ce principe, on dose les traces de carbamates (pesticides) dans l’environnement, par saponification avec de la soude puis réaction sur l’aldéhyde o-phtalique, pour
transformer la méthylamine en un dérivé fluorescent (fig. 2.24 ).
H
H
O
O
RNH 2
OPA
HS–(CH HS–(CH 2 ) 2 –OH –OH
N R
S-(CH 2 ) 2 -OH
Int. fluorescence
radiation excitatrice
cellule de fluorescence
microcellule à circulation
1 -
2 -
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
1 -
2 - pyrène
3 - benz(a) anthracène
4 - chrysène
5 - benzo(b) fluoranthène
6 - benzo(k) fluoranthène
7 - benzo(a) pyrène
8 - dibenzo(a,h) anthracène
9 - benzo(g,h,i) pérylène
10 - indéno(1,2,3cd) pyrène
repère temps mort
15 min
Mélange d'hydrocarbures
aromatiques (HPA)
excitation 280 nm
émission 390 nm
détecteur à fluorescence
Figure 2.24 Détection fluorimétrique.
Exemple de réactifs utilisés pour rendre fluorescentes les amines primaires par action
de l’OPA en présence de monothioglycol. Détail d’une cellule à circulation pour détecter la fluorescence. Dans la pratique, la fluorescence est observée dans une direction
perpendiculaire à la direction de l’excitation (reproduit avec l’autorisation de la société
Hewlett-Packard). Chromatogramme d’un mélange de quelques hydrocarbures polynucléaires aromatiques (HPA). L’intensité de fluorescence varie énormément d’un composé
à un autre, à la fois parce que la longueur d’onde d’excitation devrait être ajustée pour
chaque composé et que l’intensité de fluorescence varie également. Il existe des détecteurs programmables pour obtenir une réponse optimale.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit