2 • Chromatographie liquide haute performance
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Détection monochromatique. Le modèle de base se compose d’une source au deutérium
ou à vapeur de mercure, d’un monochromateur pour isoler une bande passante étroite
(10 nm) ou une raie (ex. la raie 254 nm du Hg), d’une cellule à circulation d’un volume de
quelques mL (trajet optique de 0,1 à 1 cm) et d’un moyen de détection optique.
source
monochromateur
cellule
à circulation
photomultiplicateur
ou photodiode
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
180
200
220
240
260
280
300
Abs.
nanomètres
1
2
3
4
1
2
3
4
acétonitrile
hexane
méthanol
tétrahydrofurane
absorbance d'une cellule de 1cm
d 'épaisseur, remplie de solvant pur
Figure 2.20 Détection photométrique.
Principe d’un détecteur photométrique à une seule longueur d’onde et spectres d’absorption de quelques solvants utilisés en chromatographie liquide. On considère que
la limite de transparence d’un solvant correspond à une absorbance de 0,2 pour 1 cm
d’épaisseur traversée.
L’essor actuel des biotechnologies, comme de la biochimie, a accru la demande d’analyse
des acides aminés (hydrolysats de protéines) ; on peut utiliser les détecteurs photométriques
à condition de réaliser avant passage dans la cellule de mesure une réaction post-colonne
avec la ninhydrine par exemple (cf. chapitre 8).
Détection polychromatique. Les détecteurs plus perfectionnés permettent soit d’enregistrer l’absorbance à plusieurs longueurs d’onde quasi-simultanément, soit de capter en une
fraction de seconde tout un domaine de longueurs d’onde sans interrompre la circulation
dans la colonne (fig. 2.21 à 2.23).
A
B
détection à λ 1
détection à λ 2
λ 1
λ
λ 2
temps
absorbance (mAU)
chromatogrammes
t A
t B
spectres UV de A et de B
B
A
ε
214 nm
230 nm
245 nm
Figure 2.21 Chromatographie d’un échantillon contenant
2 composés A et B, dont les spectres UV sont différents.
Selon le choix de la longueur d’onde de détection, le chromatogramme n’aura pas le
même aspect. Les chromatogrammes (à droite) d’un mélange de quelques pesticides
enregistrés à trois longueurs d’onde différentes illustrent ce phénomène. En analyse
quantitative, on doit donc déterminer d’abord les facteurs de réponse du détecteur
pour tous les composés analysés (cf. analyse quantitative, Chap. 1).
Le détecteur à barrette de diodes permet non seulement d’obtenir un chromatogramme,
mais il fournit des renseignements spectraux pouvant servir à s’assurer de l’identité des
composés séparés (fig. 2.22). C’est ce qu’on nomme l’analyse de certitude (cf. ch. 9).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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Détection monochromatique. Le modèle de base se compose d’une source au deutérium
ou à vapeur de mercure, d’un monochromateur pour isoler une bande passante étroite
(10 nm) ou une raie (ex. la raie 254 nm du Hg), d’une cellule à circulation d’un volume de
quelques mL (trajet optique de 0,1 à 1 cm) et d’un moyen de détection optique.
source
monochromateur
cellule
à circulation
photomultiplicateur
ou photodiode
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
180
200
220
240
260
280
300
Abs.
nanomètres
1
2
3
4
1
2
3
4
acétonitrile
hexane
méthanol
tétrahydrofurane
absorbance d'une cellule de 1cm
d 'épaisseur, remplie de solvant pur
Figure 2.20 Détection photométrique.
Principe d’un détecteur photométrique à une seule longueur d’onde et spectres d’absorption de quelques solvants utilisés en chromatographie liquide. On considère que
la limite de transparence d’un solvant correspond à une absorbance de 0,2 pour 1 cm
d’épaisseur traversée.
L’essor actuel des biotechnologies, comme de la biochimie, a accru la demande d’analyse
des acides aminés (hydrolysats de protéines) ; on peut utiliser les détecteurs photométriques
à condition de réaliser avant passage dans la cellule de mesure une réaction post-colonne
avec la ninhydrine par exemple (cf. chapitre 8).
Détection polychromatique. Les détecteurs plus perfectionnés permettent soit d’enregistrer l’absorbance à plusieurs longueurs d’onde quasi-simultanément, soit de capter en une
fraction de seconde tout un domaine de longueurs d’onde sans interrompre la circulation
dans la colonne (fig. 2.21 à 2.23).
A
B
détection à λ 1
détection à λ 2
λ 1
λ
λ 2
temps
absorbance (mAU)
chromatogrammes
t A
t B
spectres UV de A et de B
B
A
ε
214 nm
230 nm
245 nm
Figure 2.21 Chromatographie d’un échantillon contenant
2 composés A et B, dont les spectres UV sont différents.
Selon le choix de la longueur d’onde de détection, le chromatogramme n’aura pas le
même aspect. Les chromatogrammes (à droite) d’un mélange de quelques pesticides
enregistrés à trois longueurs d’onde différentes illustrent ce phénomène. En analyse
quantitative, on doit donc déterminer d’abord les facteurs de réponse du détecteur
pour tous les composés analysés (cf. analyse quantitative, Chap. 1).
Le détecteur à barrette de diodes permet non seulement d’obtenir un chromatogramme,
mais il fournit des renseignements spectraux pouvant servir à s’assurer de l’identité des
composés séparés (fig. 2.22). C’est ce qu’on nomme l’analyse de certitude (cf. ch. 9).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit