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Partie 1 • Méthodes séparatives
1 - cytochrome C
2 - myoglobine
3 - ribonucléase
4 - lysozyme
5 - chymotrypsinogène A
colonne HIC-Phenyl (type RP-18)
phase mobile :
A = (NH ) SO 2M + KH PO 0,1 M pH 7
B = KH PO 0,1 M à pH 7
gradient avec augmentation de B
de 15 à 100 % en 30 min.
détection UV 280 nm
4 2
4
2
4
2
4
794-0462
1
2
3
4
5
0
1 0
2 0
3 0
4 0 min
protéine
particule
de gel de silice
Figure 2.19 Séparation améliorée sur le principe de l’interaction hydrophobe.
Chromatogramme d’un mélange de protéines de moins en moins hydrophiles, obtenu
en diminuant au cours du temps la concentration saline (reproduit avec l’autorisation
de la société Supelco).
2.11 PRINCIPAUX DÉTECTEURS
L’analyse par chromatographie a rarement pour but de déterminer la composition totale de
l’échantillon, mais plutôt de repérer la présence ou doser un composé présent, pour lequel
on a choisi un détecteur bien adapté. Le détecteur universel n’est donc pas indispensable.
Dans certains cas, il peut même être un handicap pour la lisibilité du chromatogramme.
Plus nettement encore qu’en CPG, les aires relatives des pics d’un chromatogramme n’ont
souvent aucun rapport avec la composition molaire ou massique du mélange analysé.
Cependant quel qu’il soit, le détecteur doit réunir un certain nombre de qualités : donner
pour chaque composé détecté une réponse proportionnelle à sa concentration instantanée,
être sensible et avoir peu de bruit de fond, être stable dans le temps.
Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques des composés : absorption, fluorescence et indice de réfraction.
2.11.1 Détecteurs spectrophotométriques
La détection est basée sur la loi de Lambert-Beer ( A = ´ l c) : l’absorbance A de la
phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde l ou plusieurs longueurs d’onde dans l’UV ou le visible (cf. chapitre 9). La phase mobile ne doit pas, ou très
peu, absorber par elle-même (fig. 2.20). L’intensité de l’absorption dépend du coefficient
d’absorption molaire ´ l , ce qui rend impossible, par la simple observation d’un chromatogramme, de se faire une idée de la concentration des espèces repérées, même de manière
très approximative.
La détection UV correspond donc à une détection sélective. Pour les composés qui n’ont
pas de spectre d’absorption exploitable, on fait appel à la « dérivation » post-colonne des
analytes.
Partie 1 • Méthodes séparatives
1 - cytochrome C
2 - myoglobine
3 - ribonucléase
4 - lysozyme
5 - chymotrypsinogène A
colonne HIC-Phenyl (type RP-18)
phase mobile :
A = (NH ) SO 2M + KH PO 0,1 M pH 7
B = KH PO 0,1 M à pH 7
gradient avec augmentation de B
de 15 à 100 % en 30 min.
détection UV 280 nm
4 2
4
2
4
2
4
794-0462
1
2
3
4
5
0
1 0
2 0
3 0
4 0 min
protéine
particule
de gel de silice
Figure 2.19 Séparation améliorée sur le principe de l’interaction hydrophobe.
Chromatogramme d’un mélange de protéines de moins en moins hydrophiles, obtenu
en diminuant au cours du temps la concentration saline (reproduit avec l’autorisation
de la société Supelco).
2.11 PRINCIPAUX DÉTECTEURS
L’analyse par chromatographie a rarement pour but de déterminer la composition totale de
l’échantillon, mais plutôt de repérer la présence ou doser un composé présent, pour lequel
on a choisi un détecteur bien adapté. Le détecteur universel n’est donc pas indispensable.
Dans certains cas, il peut même être un handicap pour la lisibilité du chromatogramme.
Plus nettement encore qu’en CPG, les aires relatives des pics d’un chromatogramme n’ont
souvent aucun rapport avec la composition molaire ou massique du mélange analysé.
Cependant quel qu’il soit, le détecteur doit réunir un certain nombre de qualités : donner
pour chaque composé détecté une réponse proportionnelle à sa concentration instantanée,
être sensible et avoir peu de bruit de fond, être stable dans le temps.
Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques des composés : absorption, fluorescence et indice de réfraction.
2.11.1 Détecteurs spectrophotométriques
La détection est basée sur la loi de Lambert-Beer ( A = ´ l c) : l’absorbance A de la
phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde l ou plusieurs longueurs d’onde dans l’UV ou le visible (cf. chapitre 9). La phase mobile ne doit pas, ou très
peu, absorber par elle-même (fig. 2.20). L’intensité de l’absorption dépend du coefficient
d’absorption molaire ´ l , ce qui rend impossible, par la simple observation d’un chromatogramme, de se faire une idée de la concentration des espèces repérées, même de manière
très approximative.
La détection UV correspond donc à une détection sélective. Pour les composés qui n’ont
pas de spectre d’absorption exploitable, on fait appel à la « dérivation » post-colonne des
analytes.