2 • Chromatographie liquide haute performance
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à celle du composé à séparer (alkylammonium ou alkylsulfonate). Ceci conduit à des d’ions
globalement neutres, assez stables. De la sorte, il devient possible de séparer des cations et
des anions inorganiques avec une colonne remplie de polarité inversée.
797-0088
797-0090
b
colonne type RP-18
détection UV 254 nmi
a
AMP = adénosine monophosphate (n = 1)
ADP = adénosine diphosphate (n = 2)
ATP = adénosine triphosphate (n = 3)
O
N
N
N
N
CH 2
O
P
OH
OH
OH
NH 2
O
OH
n
AMP
AMP
ADP
ADP
ATP
ATP
min
min
0
2
4
0 2 4 6 8 10 12
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
B = méthanol
élution en augmentant B
(gradient)
2
4
797-0088
797-0090
b
colonne type RP-18
détection UV 254 nmi
a
AMP = adénosine monophosphate (n = 1)
ADP = adénosine diphosphate (n = 2)
ATP = adénosine triphosphate (n = 3)
O
N
N
N
N
CH 2
O
P
OH
OH
OH
NH 2
O
OH
n
AMP
AMP
ADP
ADP
ATP
ATP
min
min
0
2
4
0 2 4 6 8 10 12
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
B = méthanol
élution en augmentant B
(gradient)
2
4
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
+ Bu N, H SO 4 mMol.
B = méthanol
éluant A/B = 75/25.
2
4
4
2
4
n
Figure 2.18 Effet de l’appariement d’ions sur une séparation avec une colonne à polarité inversée.
Le chromatogramme d’un mélange de 3 nucléotides montre en a la situation normale
avec une élution dans l’ordre des polarités décroissantes ; en b, par contre, situation
inversée : l’ATP associé à l’ion tétrabutylammonium est devenu plus lipophile, et est
donc plus longtemps retenu (adapté d’un document Alltech).
2.10 CHROMATOGRAPHIE D’INTERACTION HYDROPHOBE
La chromatographie à interaction hydrophobe (HIC, hydrophobic interaction chromatography) permet d’améliorer la séparation des composés bioorganiques tels les protéines solubles dans l’eau. On choisit une colonne apolaire et on commence l’élution avec une phase
mobile fortement saline (sulfate d’ammonium 2 M et phosphate monosodique 0,1 M, à
pH 7). Dans ces conditions les protéines se fixent par leurs domaines hydrophobes sur la
PS. Ensuite on diminue progressivement la concentration saline afin que les protéines repassent dans la phase mobile (fig. 2.19). Ainsi elles sont éluées dans l’ordre décroissant de
leur caractère hydrophile.
Cette opération rappelle une technique expérimentale connue en chimie organique :
quand, dans une ampoule à décanter, on veut extraire avec de l’éther un composé organique
au sein d’une phase aqueuse, on ajoute de la saumure pour faire reculer la solubilité du
composé organique dans l’eau donc faciliter son extraction par l’éther.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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à celle du composé à séparer (alkylammonium ou alkylsulfonate). Ceci conduit à des d’ions
globalement neutres, assez stables. De la sorte, il devient possible de séparer des cations et
des anions inorganiques avec une colonne remplie de polarité inversée.
797-0088
797-0090
b
colonne type RP-18
détection UV 254 nmi
a
AMP = adénosine monophosphate (n = 1)
ADP = adénosine diphosphate (n = 2)
ATP = adénosine triphosphate (n = 3)
O
N
N
N
N
CH 2
O
P
OH
OH
OH
NH 2
O
OH
n
AMP
AMP
ADP
ADP
ATP
ATP
min
min
0
2
4
0 2 4 6 8 10 12
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
B = méthanol
élution en augmentant B
(gradient)
2
4
797-0088
797-0090
b
colonne type RP-18
détection UV 254 nmi
a
AMP = adénosine monophosphate (n = 1)
ADP = adénosine diphosphate (n = 2)
ATP = adénosine triphosphate (n = 3)
O
N
N
N
N
CH 2
O
P
OH
OH
OH
NH 2
O
OH
n
AMP
AMP
ADP
ADP
ATP
ATP
min
min
0
2
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0 2 4 6 8 10 12
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
B = méthanol
élution en augmentant B
(gradient)
2
4
phase mobile :
A = 0,1 M K HPO , pH = 6
+ Bu N, H SO 4 mMol.
B = méthanol
éluant A/B = 75/25.
2
4
4
2
4
n
Figure 2.18 Effet de l’appariement d’ions sur une séparation avec une colonne à polarité inversée.
Le chromatogramme d’un mélange de 3 nucléotides montre en a la situation normale
avec une élution dans l’ordre des polarités décroissantes ; en b, par contre, situation
inversée : l’ATP associé à l’ion tétrabutylammonium est devenu plus lipophile, et est
donc plus longtemps retenu (adapté d’un document Alltech).
2.10 CHROMATOGRAPHIE D’INTERACTION HYDROPHOBE
La chromatographie à interaction hydrophobe (HIC, hydrophobic interaction chromatography) permet d’améliorer la séparation des composés bioorganiques tels les protéines solubles dans l’eau. On choisit une colonne apolaire et on commence l’élution avec une phase
mobile fortement saline (sulfate d’ammonium 2 M et phosphate monosodique 0,1 M, à
pH 7). Dans ces conditions les protéines se fixent par leurs domaines hydrophobes sur la
PS. Ensuite on diminue progressivement la concentration saline afin que les protéines repassent dans la phase mobile (fig. 2.19). Ainsi elles sont éluées dans l’ordre décroissant de
leur caractère hydrophile.
Cette opération rappelle une technique expérimentale connue en chimie organique :
quand, dans une ampoule à décanter, on veut extraire avec de l’éther un composé organique
au sein d’une phase aqueuse, on ajoute de la saumure pour faire reculer la solubilité du
composé organique dans l’eau donc faciliter son extraction par l’éther.
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit