50
Partie 1 • Méthodes séparatives
Avec une phase stationnaire dont la partie active ressemble à une couche paraffinique,
l’ordre d’élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales. Ainsi
avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu’un composé apolaire. Dans
ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. En revanche, les composés polaires sont assez difficiles à séparer entre eux. Il faut réaliser des gradients d’élution en
diminuant progressivement au cours du temps la concentration en eau (polaire) au profit du
modifiant choisi (moins polaire). On commencera par exemple avec un mélange 80/20 %
eau/acétonitrile pour terminer à la composition de 40/60 %. C’est le domaine de la chromatographie d’interaction hydrophile.
On reconnaît quatre types d’interactions entre les molécules de solvant et de soluté :
– ionique quand soluté et solvant ont tous deux des moments dipolaires ;
– de dispersion due à l’attraction entre elles des molécules voisines ;
– diélectriques, qui favorisent la dissolution des solutés ioniques dans les solvants polaires ;
– par liaisons hydrogène, quand sont réunis un soluté et un solvant dont l’un est donneur et
l’autre accepteur de protons.
colonne LUNA NH2
Hexane/Ethanol 85:15
UV 240 nm
1 2
3
4 5
6
7
1 glucose
2 maltose
3 maltotriose
4 maltotétraose
5 maltopentose
6 maltohexaose
7 maltoheptaose
C6H12O6
C12H22O11
C18H32O16
C24H42O11
C30H52O26
C36H62O31
C42H72O36
min
0
2
4
1
3
Figure 2.17 Séparation de sucres sur une phase « amine ».
L’ordre d’élution des 7 sucres homologues nous indique que la phase stationnaire est
polaire et que le pouvoir d’élution de la phase mobile diminue d’autant plus que la
masse moléculaire est plus grande.
La séparation des composés très polaires sur les phases stationnaires de type RP-18 impose l’usage d’une phase mobile très riche en eau. Dans ces conditions, il arrive que la phase
stationnaire, qui est hydrophobe, devienne subitement non mouillable. La séparation devient
mauvaise. C’est pourquoi on choisit de préférence des phases présentant une polarité résiduelle pour maintenir l’interaction entre les analytes et l’eau de la phase mobile (fig. 2.17).
2.9 CHROMATOGRAPHIE D’APPARIEMENT D’IONS
La chromatographie par appariement d’ions (PIC, paired ion chromatography) permet
d’améliorer la séparation des composés ioniques ou très polaires quand on décide d’utiliser
une colonne apolaire sur laquelle ces composés ont trop peu d’affinité (fig. 2.18). Pour
augmenter leur temps de rétention, on doit diminuer leur caractère ionique. Il suffit, pour
certains, de modifier le pH, mais pour d’autres, on ajoute à la phase mobile un composé
porteur à la fois d’une chaîne carbonée (peu polaire) et d’un groupement de charge opposée
Partie 1 • Méthodes séparatives
Avec une phase stationnaire dont la partie active ressemble à une couche paraffinique,
l’ordre d’élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les phases normales. Ainsi
avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu’un composé apolaire. Dans
ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. En revanche, les composés polaires sont assez difficiles à séparer entre eux. Il faut réaliser des gradients d’élution en
diminuant progressivement au cours du temps la concentration en eau (polaire) au profit du
modifiant choisi (moins polaire). On commencera par exemple avec un mélange 80/20 %
eau/acétonitrile pour terminer à la composition de 40/60 %. C’est le domaine de la chromatographie d’interaction hydrophile.
On reconnaît quatre types d’interactions entre les molécules de solvant et de soluté :
– ionique quand soluté et solvant ont tous deux des moments dipolaires ;
– de dispersion due à l’attraction entre elles des molécules voisines ;
– diélectriques, qui favorisent la dissolution des solutés ioniques dans les solvants polaires ;
– par liaisons hydrogène, quand sont réunis un soluté et un solvant dont l’un est donneur et
l’autre accepteur de protons.
colonne LUNA NH2
Hexane/Ethanol 85:15
UV 240 nm
1 2
3
4 5
6
7
1 glucose
2 maltose
3 maltotriose
4 maltotétraose
5 maltopentose
6 maltohexaose
7 maltoheptaose
C6H12O6
C12H22O11
C18H32O16
C24H42O11
C30H52O26
C36H62O31
C42H72O36
min
0
2
4
1
3
Figure 2.17 Séparation de sucres sur une phase « amine ».
L’ordre d’élution des 7 sucres homologues nous indique que la phase stationnaire est
polaire et que le pouvoir d’élution de la phase mobile diminue d’autant plus que la
masse moléculaire est plus grande.
La séparation des composés très polaires sur les phases stationnaires de type RP-18 impose l’usage d’une phase mobile très riche en eau. Dans ces conditions, il arrive que la phase
stationnaire, qui est hydrophobe, devienne subitement non mouillable. La séparation devient
mauvaise. C’est pourquoi on choisit de préférence des phases présentant une polarité résiduelle pour maintenir l’interaction entre les analytes et l’eau de la phase mobile (fig. 2.17).
2.9 CHROMATOGRAPHIE D’APPARIEMENT D’IONS
La chromatographie par appariement d’ions (PIC, paired ion chromatography) permet
d’améliorer la séparation des composés ioniques ou très polaires quand on décide d’utiliser
une colonne apolaire sur laquelle ces composés ont trop peu d’affinité (fig. 2.18). Pour
augmenter leur temps de rétention, on doit diminuer leur caractère ionique. Il suffit, pour
certains, de modifier le pH, mais pour d’autres, on ajoute à la phase mobile un composé
porteur à la fois d’une chaîne carbonée (peu polaire) et d’un groupement de charge opposée