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Partie 3 • Autres méthodes
La mesure finale d’absorbance peut être remplacée par une mesure de fluorescence (on
réalise un ELISA fluorescent). Dans ce cas le conjugué enzymatique choisi est une phosphatase alcaline qui convertit le substrat spécifique en un produit fluorescent.
17.8 AUTRES TECHNIQUES IMMUNOENZYMATIQUES
La technique précédente ELISA avec compétition en milieu hétérogène existe sous plusieurs
variantes. L’une d’elles, mise au point par la société Ohmicron, consiste à fixer de manière
covalente les anticorps, non plus sur la paroi mais sur des particules magnétiques d’environ
1 mm (fig. 17.7). Cette méthode a pour avantages que :
➤ la quantité d’anticorps à mettre en jeu n’est pas limitée comme c’est le cas pour la paroi
du tube ;
➤ la réaction anticorps/antigène est favorisée car les deux partenaires se mélangent mieux.
Le milieu est à mi-chemin entre une phase homogène et une phase hétérogène.
E
E
E
procédé OHMICRON
procédé EMIT
conjugué enzymatique
inactivé lorsque fixé
anticorps fixé
sur support magnétique
composé à doser
composé à doser
conjugué enzymatique
conjugué enzymatique
aimant
2
1
E
E
E
E
E
E
E
E
E
Figure 17.7 Les procédés OHMICRON et EMIT, variantes de l’ELISA de base.
Le test se déroule comme précédemment à la différence près que l’anticorps étant fixé aux
particules magnétiques, on applique après incubation et avant lavage un champ magnétique
pour coller les anticorps à la paroi.
Une autre méthode en phase homogène, reconnue pour doser des médicaments et des hormones est désignée par EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Test, de Syva-Biomérieux).
Dans le tube contenant l’anticorps libre (non fixé), on ajoute l’échantillon et une quantité
connue de l’antigène avec son enzyme (le conjugué enzymatique). Il se produit la compétition habituelle, excepté que l’antigène conjugué, fixé par l’anticorps, perd ses propriétés
enzymatiques. Ainsi on évite l’étape de lavage et on ajoute directement le substrat. La coloration est due cette fois à la fraction de l’enzyme non fixée. Moins il y aura de composé,
plus une part importante de l’enzyme sera dénaturée au contact de la paroi, et moins la
coloration sera forte.
Partie 3 • Autres méthodes
La mesure finale d’absorbance peut être remplacée par une mesure de fluorescence (on
réalise un ELISA fluorescent). Dans ce cas le conjugué enzymatique choisi est une phosphatase alcaline qui convertit le substrat spécifique en un produit fluorescent.
17.8 AUTRES TECHNIQUES IMMUNOENZYMATIQUES
La technique précédente ELISA avec compétition en milieu hétérogène existe sous plusieurs
variantes. L’une d’elles, mise au point par la société Ohmicron, consiste à fixer de manière
covalente les anticorps, non plus sur la paroi mais sur des particules magnétiques d’environ
1 mm (fig. 17.7). Cette méthode a pour avantages que :
➤ la quantité d’anticorps à mettre en jeu n’est pas limitée comme c’est le cas pour la paroi
du tube ;
➤ la réaction anticorps/antigène est favorisée car les deux partenaires se mélangent mieux.
Le milieu est à mi-chemin entre une phase homogène et une phase hétérogène.
E
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procédé OHMICRON
procédé EMIT
conjugué enzymatique
inactivé lorsque fixé
anticorps fixé
sur support magnétique
composé à doser
composé à doser
conjugué enzymatique
conjugué enzymatique
aimant
2
1
E
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Figure 17.7 Les procédés OHMICRON et EMIT, variantes de l’ELISA de base.
Le test se déroule comme précédemment à la différence près que l’anticorps étant fixé aux
particules magnétiques, on applique après incubation et avant lavage un champ magnétique
pour coller les anticorps à la paroi.
Une autre méthode en phase homogène, reconnue pour doser des médicaments et des hormones est désignée par EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Test, de Syva-Biomérieux).
Dans le tube contenant l’anticorps libre (non fixé), on ajoute l’échantillon et une quantité
connue de l’antigène avec son enzyme (le conjugué enzymatique). Il se produit la compétition habituelle, excepté que l’antigène conjugué, fixé par l’anticorps, perd ses propriétés
enzymatiques. Ainsi on évite l’étape de lavage et on ajoute directement le substrat. La coloration est due cette fois à la fraction de l’enzyme non fixée. Moins il y aura de composé,
plus une part importante de l’enzyme sera dénaturée au contact de la paroi, et moins la
coloration sera forte.