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Partie 3 • Autres méthodes
17.7.1 Conduite d’un test ELISA avec compétition
1. Dans la première étape (fig. 17.5) on introduit une solution de l’échantillon, ou une
solution étalon du composé à doser, dans un tube (ou une cuvette de microplaque) à fond
transparent dont la paroi de matière plastique a été sensibilisée, c’est-à-dire recouverte
de l’anticorps adapté fixé à la surface par adsorption.
2. On ajoute ensuite un volume connu d’une solution de ce même composé, relié par ligation covalente à une enzyme (ce conjugué enzymatique est souvent la peroxydase du
radis noir). Les deux formes du composé entrent en concurrence pendant la durée de
l’incubation pour se fixer sur les anticorps que porte la paroi.
3. Après un certain temps d’incubation (ex. 30 min.), les tubes sont lavés à plusieurs reprises avec de l’eau. Seules les molécules fixées restent dans les tubes. La quantité de
composé associé à l’enzyme, sera d’autant plus grande qu’il y avait peu de ce composé
à l’état libre dans l’échantillon.
4. On ajoute maintenant le substrat S spécifique de l’enzyme ainsi qu’un chromogène C,
destiné à réagir sur le produit de réaction (ex. tétraméthylbenzidine).
5. L’enzyme fixée va transformer un grand nombre de molécules S en espèces P, qui vont
réagir avec C pour donner un colorant. Le facteur d’amplification de l’enzyme rend ce
type de test très sensible. Moins il y a de composé à doser dans l’échantillon, plus il y a
d’enzyme fixée et plus la coloration est forte.
6. Enfin on arrête la réaction au bout d’un temps assez court en ajoutant un acide fort qui
détruit l’enzyme. Il reste à procéder à la lecture du test avec un colorimètre.
La peroxydase du radis noir (ou Horseradish peroxidase, M = 44 000 Da) est stable et réactive. Elle possède 4 résidus lysine qui ne participent pas à son activité, et qui servent à son
couplage. Comme son nom l’indique, un substrat S de cette enzyme est le peroxyde d’hydrogène qu’elle décompose en faisant apparaître de l’oxygène qui réagit sur le chromogène
(TMB, tétraméthylbenzidine). En présence de luminol, il apparaît une chimifluorescence
stable pendant plusieurs minutes à l’origine de dosages extrêmement sensibles.
S
C
- composé à doser
- conjugué enzymatique
- substrat
- chromogène
- anticorps spécifique
-produit
- colorant
1
4
5
2
3
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
S
S
S
S
S
S
S
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
1 cm
6
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
lecture UV
Figure 17.5 Les différentes étapes d’un test immunoenzymatique de type ELISA avec compétition (voir
texte). En analyse clinique, il existe de nombreux dosages de ce type.
Partie 3 • Autres méthodes
17.7.1 Conduite d’un test ELISA avec compétition
1. Dans la première étape (fig. 17.5) on introduit une solution de l’échantillon, ou une
solution étalon du composé à doser, dans un tube (ou une cuvette de microplaque) à fond
transparent dont la paroi de matière plastique a été sensibilisée, c’est-à-dire recouverte
de l’anticorps adapté fixé à la surface par adsorption.
2. On ajoute ensuite un volume connu d’une solution de ce même composé, relié par ligation covalente à une enzyme (ce conjugué enzymatique est souvent la peroxydase du
radis noir). Les deux formes du composé entrent en concurrence pendant la durée de
l’incubation pour se fixer sur les anticorps que porte la paroi.
3. Après un certain temps d’incubation (ex. 30 min.), les tubes sont lavés à plusieurs reprises avec de l’eau. Seules les molécules fixées restent dans les tubes. La quantité de
composé associé à l’enzyme, sera d’autant plus grande qu’il y avait peu de ce composé
à l’état libre dans l’échantillon.
4. On ajoute maintenant le substrat S spécifique de l’enzyme ainsi qu’un chromogène C,
destiné à réagir sur le produit de réaction (ex. tétraméthylbenzidine).
5. L’enzyme fixée va transformer un grand nombre de molécules S en espèces P, qui vont
réagir avec C pour donner un colorant. Le facteur d’amplification de l’enzyme rend ce
type de test très sensible. Moins il y a de composé à doser dans l’échantillon, plus il y a
d’enzyme fixée et plus la coloration est forte.
6. Enfin on arrête la réaction au bout d’un temps assez court en ajoutant un acide fort qui
détruit l’enzyme. Il reste à procéder à la lecture du test avec un colorimètre.
La peroxydase du radis noir (ou Horseradish peroxidase, M = 44 000 Da) est stable et réactive. Elle possède 4 résidus lysine qui ne participent pas à son activité, et qui servent à son
couplage. Comme son nom l’indique, un substrat S de cette enzyme est le peroxyde d’hydrogène qu’elle décompose en faisant apparaître de l’oxygène qui réagit sur le chromogène
(TMB, tétraméthylbenzidine). En présence de luminol, il apparaît une chimifluorescence
stable pendant plusieurs minutes à l’origine de dosages extrêmement sensibles.
S
C
- composé à doser
- conjugué enzymatique
- substrat
- chromogène
- anticorps spécifique
-produit
- colorant
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lecture UV
Figure 17.5 Les différentes étapes d’un test immunoenzymatique de type ELISA avec compétition (voir
texte). En analyse clinique, il existe de nombreux dosages de ce type.