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Partie 2 • Méthodes spectrométriques
un réactif fluorophore par réaction chimique (les 7-hydroxycoumarines peuvent être utilisées à cet effet). C’est la dérivation de fluorescence, qui rappelle le procédé employé en
colorimétrie.
Pour doser les métaux sous forme de cations, on forme des complexes de chélation avec
l’oxine (8-hydroxyquinoléine), l’alizarine ou la benzoïne, extractibles par les solvants organiques.
En biochimie la fluorescence trouve de nombreuses applications pour quantifier les protéines ou les acides nucléiques au moyen de réactifs qui se fixent spécifiquement sur ces
composés. Cette approche, quelquefois très élaborée, en association avec l’électrophorèse,
constitue une alternative plus sensible et moins contraignante que la révélation au moyen
de substrats radioactifs.
La chimifluorescence (à ne pas confondre avec la chimiluminescence) est également
un moyen particulièrement sensible de détection de protéines spécifiques. On doit disposer
pour cela d’un anticorps spécifique porteur d’un conjugué enzymatique, tel une phosphatase
(fig. 11.11). Mis en présence d’un substrat tel un dérivé phosphaté de la fluorescéine, il y a
libération de cette dernière facile à mettre en évidence par sa fluorescence déclenchée par
une source excitatrice.
excitation 532 nm
coupure
émission 550-570 nm
fluorescéine
groupement phosphate
substrat
"fluorescéine phosphatée"
anticorps conjugué
phosphatase
protéine
Figure 11.11 Processus d’un dosage de protéine par chimifluorescence en biochimie.
La figure regroupe simplement les réactions mises en jeu sachant que pour réaliser un
tel dosage on suit un protocole dans lequel les différentes réactions se font au cours
d’étapes distinctes.
En analyse par CLHP, on peut ainsi marquer les amines (avec d’autres coumarines), ce
qui permet des seuils de détection extrêmement bas, de l’ordre de l’attomole (10
−18 M).
Parmi les applications classiques actuelles de la fluorescence, figurent les dosages des hydrocarbures polycycliques aromatiques (« HPA ») dans les eaux de consommation, par
CLHP. Dans ce cas, le détecteur est muni d’une cellule de fluorescence à circulation, installée en aval de la colonne du chromatographe. Ce mode de détection est particulièrement
bien adapté pour atteindre les seuils très bas imposés par la législation. Ce même procédé
permet de doser également les aflatoxines (fig. 11.12), ainsi que de nombreux autres composés organiques (adrénaline, quinine, stéroïdes, vitamines).
Partie 2 • Méthodes spectrométriques
un réactif fluorophore par réaction chimique (les 7-hydroxycoumarines peuvent être utilisées à cet effet). C’est la dérivation de fluorescence, qui rappelle le procédé employé en
colorimétrie.
Pour doser les métaux sous forme de cations, on forme des complexes de chélation avec
l’oxine (8-hydroxyquinoléine), l’alizarine ou la benzoïne, extractibles par les solvants organiques.
En biochimie la fluorescence trouve de nombreuses applications pour quantifier les protéines ou les acides nucléiques au moyen de réactifs qui se fixent spécifiquement sur ces
composés. Cette approche, quelquefois très élaborée, en association avec l’électrophorèse,
constitue une alternative plus sensible et moins contraignante que la révélation au moyen
de substrats radioactifs.
La chimifluorescence (à ne pas confondre avec la chimiluminescence) est également
un moyen particulièrement sensible de détection de protéines spécifiques. On doit disposer
pour cela d’un anticorps spécifique porteur d’un conjugué enzymatique, tel une phosphatase
(fig. 11.11). Mis en présence d’un substrat tel un dérivé phosphaté de la fluorescéine, il y a
libération de cette dernière facile à mettre en évidence par sa fluorescence déclenchée par
une source excitatrice.
excitation 532 nm
coupure
émission 550-570 nm
fluorescéine
groupement phosphate
substrat
"fluorescéine phosphatée"
anticorps conjugué
phosphatase
protéine
Figure 11.11 Processus d’un dosage de protéine par chimifluorescence en biochimie.
La figure regroupe simplement les réactions mises en jeu sachant que pour réaliser un
tel dosage on suit un protocole dans lequel les différentes réactions se font au cours
d’étapes distinctes.
En analyse par CLHP, on peut ainsi marquer les amines (avec d’autres coumarines), ce
qui permet des seuils de détection extrêmement bas, de l’ordre de l’attomole (10
−18 M).
Parmi les applications classiques actuelles de la fluorescence, figurent les dosages des hydrocarbures polycycliques aromatiques (« HPA ») dans les eaux de consommation, par
CLHP. Dans ce cas, le détecteur est muni d’une cellule de fluorescence à circulation, installée en aval de la colonne du chromatographe. Ce mode de détection est particulièrement
bien adapté pour atteindre les seuils très bas imposés par la législation. Ce même procédé
permet de doser également les aflatoxines (fig. 11.12), ainsi que de nombreux autres composés organiques (adrénaline, quinine, stéroïdes, vitamines).