11 • Fluorimétrie et chimiluminescence
217
H
H
H
H
détection UV à 365 nm
détection
fluorimétrique
à 440 nm
(excit. 360 nm)
structure des aflatoxines B et G
1 - aflat. G (0,3 mg/L)
2 - aflat. G (1 mg/L)
3 - aflat. B (0,3 mg/L)
4 - aflat. B (1 mg/L)
2
1
2
1
conditions :
colonne RP-18, 25 cm, particules 5 µm
phase mobile : eau, acétonitrile, méthanol
(60:20:20)
injection du mélange des 4 aflatoxines :
0
5
10 min
0
5
10 min
aflatoxine B 1
aflatoxine G 1
nota :
les aflatoxines B et G ne possèdent pas
de double liaison dans le cycle de gauche
2
2
OMe
OMe
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
1
2
3
4
miroir
PM
mono.
d'excitation
monochromateur
d'émission
cellule
lentilles
phtodiodes
lampe à
arc xénon
Figure 11.12 Comparaison d’une détection UV et par fluorescence après séparation
chromatographique.
Les aflatoxines, contaminants cancérogènes présents dans certains lots de céréales, font
l’objet de contrôles par CLHP. On remarquera que, par détection UV, les intensités des
pics varient comme les concentrations des 4 composés, alors que la détection par fluorescence est beaucoup plus sensible pour les G 2 et B 2 (reproduit avec l’autorisation de
la société SUPELCO). En bas à gauche, agencement des différentes parties d’un détecteur basé sur la fluorescence. Il permet de trouver pour chaque composé élué le meilleur
couple excitation /émission en un temps très bref sans interrompre le déroulement de
la chromatographie. Les chromatogrammes obtenus sont étudiées en différé (reproduit
d’après un document de la société Agilent technologies).
11.7 FLUORIMÉTRIE RÉSOLUE DANS LE TEMPS
Les avancées technologiques permettent d’accéder désormais aux courbes de décroissance
de fluorescence. Sachant que l’intensité lumineuse décroît très vite, on soumet le composé
en solution très diluée à une source pulsée (diode laser par exemple) de quelques picosecondes, de manière répétitive à des fréquence de plusieurs mégahertz. Au cours des cycles
successifs, quand la source est éteinte, le détecteur mesure le temps écoulé jusqu’à l’instant
aléatoire où un photon de fluorescence l’atteint. Il incrémente alors le canal mémoire qui
est réservé au temps correspondant. Après avoir accumulé un grand nombre de photons, le
graphe de la décroissance est finalement reconstruit en faisant un histogramme du contenu
de tous les canaux mémoire (fig. 11.13).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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détection UV à 365 nm
détection
fluorimétrique
à 440 nm
(excit. 360 nm)
structure des aflatoxines B et G
1 - aflat. G (0,3 mg/L)
2 - aflat. G (1 mg/L)
3 - aflat. B (0,3 mg/L)
4 - aflat. B (1 mg/L)
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conditions :
colonne RP-18, 25 cm, particules 5 µm
phase mobile : eau, acétonitrile, méthanol
(60:20:20)
injection du mélange des 4 aflatoxines :
0
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10 min
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10 min
aflatoxine B 1
aflatoxine G 1
nota :
les aflatoxines B et G ne possèdent pas
de double liaison dans le cycle de gauche
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mono.
d'excitation
monochromateur
d'émission
cellule
lentilles
phtodiodes
lampe à
arc xénon
Figure 11.12 Comparaison d’une détection UV et par fluorescence après séparation
chromatographique.
Les aflatoxines, contaminants cancérogènes présents dans certains lots de céréales, font
l’objet de contrôles par CLHP. On remarquera que, par détection UV, les intensités des
pics varient comme les concentrations des 4 composés, alors que la détection par fluorescence est beaucoup plus sensible pour les G 2 et B 2 (reproduit avec l’autorisation de
la société SUPELCO). En bas à gauche, agencement des différentes parties d’un détecteur basé sur la fluorescence. Il permet de trouver pour chaque composé élué le meilleur
couple excitation /émission en un temps très bref sans interrompre le déroulement de
la chromatographie. Les chromatogrammes obtenus sont étudiées en différé (reproduit
d’après un document de la société Agilent technologies).
11.7 FLUORIMÉTRIE RÉSOLUE DANS LE TEMPS
Les avancées technologiques permettent d’accéder désormais aux courbes de décroissance
de fluorescence. Sachant que l’intensité lumineuse décroît très vite, on soumet le composé
en solution très diluée à une source pulsée (diode laser par exemple) de quelques picosecondes, de manière répétitive à des fréquence de plusieurs mégahertz. Au cours des cycles
successifs, quand la source est éteinte, le détecteur mesure le temps écoulé jusqu’à l’instant
aléatoire où un photon de fluorescence l’atteint. Il incrémente alors le canal mémoire qui
est réservé au temps correspondant. Après avoir accumulé un grand nombre de photons, le
graphe de la décroissance est finalement reconstruit en faisant un histogramme du contenu
de tous les canaux mémoire (fig. 11.13).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit