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Partie 2 • Méthodes spectrométriques
layer chacun une bande spectrale. On obtient le spectre d’émission en maintenant la longueur d’onde d’excitation fixe, et le spectre d’excitation en maintenant la longueur d’onde
d’émission fixe.
Les spectrofluorimètres disposent de logiciels qui peuvent déterminer automatiquement
le meilleur couple de longueurs d’onde excitation/émission (fig. 11.10).
Manuellement le processus peut se faire par la méthode dite « un seul facteur à la fois » :
➤ on enregistre le spectre UV du composé avec un spectrophotomètre UV/VIS ;
➤ on règle le monochromateur d’excitation a la valeur correspondant au maximum du
spectre d’absorption ;
➤ on enregistre le spectre de fluorescence ;
➤ on règle le monochromateur d’émission à la longueur d’onde du maximum de fluorescence et on fait varier la longueur d’onde d’excitation. On obtient le spectre d’excitation
qui permet un meilleur choix final de la radiation excitatrice (qui peut être distincte de
celle correspondant au maximum d’absorption du spectre UV).
PM de référence
réseau
volet mobile
réseau
monochromateur
d'excitation
monochromateur
d'émission
fentes
détecteur (PM)
miroir
semi-transparent
lampe xénon 150W
cuve
échantillon
Figure 11.9 Schéma du spectrofluorimètre Shimadzu F-4500.
Une fraction du faisceau incident, réfléchie par un miroir semi-transparent, arrive sur
une photodiode de référence. La comparaison des signaux des deux détecteurs permet
d’éliminer la dérive de la source. Ce procédé à un seul faisceau permet d’obtenir la stabilité propre aux appareils à double faisceau. Les spectres présentent souvent des petites
différences lorsqu’ils proviennent d’appareils différents (reproduit avec l’autorisation de
la société Shimadzu).
Certains instruments permettent la mesure des durées de vie de fluorescence, bien que
celles-ci soient très courtes. Il existe plusieurs méthodes basées soit sur l’enregistrement
de la courbe de décroissance de la lumière émise lorsque l’excitation a cessé, soit sur la
comparaison de la modulation de la fluorescence en fonction d’une modulation rapide de
l’excitation. La première méthode impose d’utiliser une source pulsée (laser) et la seconde
une source modulée de fréquence élevée. En analysant le signal obtenu (modulation et phase)
en fonction de la fréquence de la source excitatrice, il est ainsi possible de calculer la durée
de vie de fluorescence.
Partie 2 • Méthodes spectrométriques
layer chacun une bande spectrale. On obtient le spectre d’émission en maintenant la longueur d’onde d’excitation fixe, et le spectre d’excitation en maintenant la longueur d’onde
d’émission fixe.
Les spectrofluorimètres disposent de logiciels qui peuvent déterminer automatiquement
le meilleur couple de longueurs d’onde excitation/émission (fig. 11.10).
Manuellement le processus peut se faire par la méthode dite « un seul facteur à la fois » :
➤ on enregistre le spectre UV du composé avec un spectrophotomètre UV/VIS ;
➤ on règle le monochromateur d’excitation a la valeur correspondant au maximum du
spectre d’absorption ;
➤ on enregistre le spectre de fluorescence ;
➤ on règle le monochromateur d’émission à la longueur d’onde du maximum de fluorescence et on fait varier la longueur d’onde d’excitation. On obtient le spectre d’excitation
qui permet un meilleur choix final de la radiation excitatrice (qui peut être distincte de
celle correspondant au maximum d’absorption du spectre UV).
PM de référence
réseau
volet mobile
réseau
monochromateur
d'excitation
monochromateur
d'émission
fentes
détecteur (PM)
miroir
semi-transparent
lampe xénon 150W
cuve
échantillon
Figure 11.9 Schéma du spectrofluorimètre Shimadzu F-4500.
Une fraction du faisceau incident, réfléchie par un miroir semi-transparent, arrive sur
une photodiode de référence. La comparaison des signaux des deux détecteurs permet
d’éliminer la dérive de la source. Ce procédé à un seul faisceau permet d’obtenir la stabilité propre aux appareils à double faisceau. Les spectres présentent souvent des petites
différences lorsqu’ils proviennent d’appareils différents (reproduit avec l’autorisation de
la société Shimadzu).
Certains instruments permettent la mesure des durées de vie de fluorescence, bien que
celles-ci soient très courtes. Il existe plusieurs méthodes basées soit sur l’enregistrement
de la courbe de décroissance de la lumière émise lorsque l’excitation a cessé, soit sur la
comparaison de la modulation de la fluorescence en fonction d’une modulation rapide de
l’excitation. La première méthode impose d’utiliser une source pulsée (laser) et la seconde
une source modulée de fréquence élevée. En analysant le signal obtenu (modulation et phase)
en fonction de la fréquence de la source excitatrice, il est ainsi possible de calculer la durée
de vie de fluorescence.