11 • Fluorimétrie et chimiluminescence
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11.5.1 Fluorimètres à rapport de fluorescence (méthode ratiométrique)
La lumière émise par la source traverse d’abord le monochromateur d’excitation qui permet
de sélectionner la bande étroite de longueurs d’onde (15 nm) qui va servir à exciter l’échantillon. Une partie de la fluorescence émise par le composé est captée dans une direction
perpendiculaire ou parallèle (selon les modèles) au faisceau incident. Cette lumière traverse
le monochromateur d’émission qui sélectionne la longueur d’onde de mesure avant d’atteindre le détecteur. De nombreux constructeurs commercialisent des modèles avec filtres
(fig. 11.8). Ces appareils sont de type monofaisceau. Ils comportent un compartiment à tourelle dans laquelle sont placées à la fois les cuves contenant les solutions étalons, l’échantillon ainsi qu’une cuve remplie d’un composé à usage de standard fluorescent. En alternant
sur le trajet optique les solutions étalons et échantillon et le standard fluorescent on mesure le rapport de fluorescence qui sert à la fois à construire la courbe d’étalonnage et,
pour l’échantillon, de paramètre de mesure. On élimine ainsi les fluctuations possibles de la
source et bon nombre de paramètres de réglage de l’appareil. Les standards courants utilisés
dans cette méthode ratiométrique sont généralement des solutions de sulfate de quinine, de
rhodamine B ou de 2-aminopyridine.
L’emploi d’une lampe flash xénon comme source permet d’étudier la fluorescence après
extinction de la source. Cette méthode est connue en immunologie où les complexes fluorescents obtenus avec les sels de lanthane ont une durée de vie de fluorescence d’environ 1 ms,
suffisante pour être à l’origine de dosages très sensibles (de l’ordre de la picomole).
source
détecteur
filtres d'excitation (10 nm)
filtres d'émission (10 nm)
fibre optique
micro-puits
I 0
I F
plaque de 96 micro-puits (0,5 mL)
405
460
510
555
590
620
355
444
485
530
584
320
Figure 11.8 Schéma optique simplifié d’un fluorimètre à lecteur de micro-puits.
Une fibre optique amène la lumière excitatrice au niveau du puits choisi et une seconde fibre récupère la fluorescence, ici sous une géométrie frontale. Pour le contrôle
des résultats en chimie combinatoire et autres méthodes de screening en immunologie/enzymologie ces fluorimètres peuvent recevoir des micro-plaques comportant de 6
à 384 puits.
11.5.2 Spectrofluorimètres
Les spectrofluorimètres sont dotés de fonctions qui leur permettent l’étude plus complète
des composés fluorescents, notamment par l’enregistrement de leurs spectres d’émission
et d’excitation (fig. 11.9). Ils disposent de deux monochromateurs motorisés pouvant ba© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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11.5.1 Fluorimètres à rapport de fluorescence (méthode ratiométrique)
La lumière émise par la source traverse d’abord le monochromateur d’excitation qui permet
de sélectionner la bande étroite de longueurs d’onde (15 nm) qui va servir à exciter l’échantillon. Une partie de la fluorescence émise par le composé est captée dans une direction
perpendiculaire ou parallèle (selon les modèles) au faisceau incident. Cette lumière traverse
le monochromateur d’émission qui sélectionne la longueur d’onde de mesure avant d’atteindre le détecteur. De nombreux constructeurs commercialisent des modèles avec filtres
(fig. 11.8). Ces appareils sont de type monofaisceau. Ils comportent un compartiment à tourelle dans laquelle sont placées à la fois les cuves contenant les solutions étalons, l’échantillon ainsi qu’une cuve remplie d’un composé à usage de standard fluorescent. En alternant
sur le trajet optique les solutions étalons et échantillon et le standard fluorescent on mesure le rapport de fluorescence qui sert à la fois à construire la courbe d’étalonnage et,
pour l’échantillon, de paramètre de mesure. On élimine ainsi les fluctuations possibles de la
source et bon nombre de paramètres de réglage de l’appareil. Les standards courants utilisés
dans cette méthode ratiométrique sont généralement des solutions de sulfate de quinine, de
rhodamine B ou de 2-aminopyridine.
L’emploi d’une lampe flash xénon comme source permet d’étudier la fluorescence après
extinction de la source. Cette méthode est connue en immunologie où les complexes fluorescents obtenus avec les sels de lanthane ont une durée de vie de fluorescence d’environ 1 ms,
suffisante pour être à l’origine de dosages très sensibles (de l’ordre de la picomole).
source
détecteur
filtres d'excitation (10 nm)
filtres d'émission (10 nm)
fibre optique
micro-puits
I 0
I F
plaque de 96 micro-puits (0,5 mL)
405
460
510
555
590
620
355
444
485
530
584
320
Figure 11.8 Schéma optique simplifié d’un fluorimètre à lecteur de micro-puits.
Une fibre optique amène la lumière excitatrice au niveau du puits choisi et une seconde fibre récupère la fluorescence, ici sous une géométrie frontale. Pour le contrôle
des résultats en chimie combinatoire et autres méthodes de screening en immunologie/enzymologie ces fluorimètres peuvent recevoir des micro-plaques comportant de 6
à 384 puits.
11.5.2 Spectrofluorimètres
Les spectrofluorimètres sont dotés de fonctions qui leur permettent l’étude plus complète
des composés fluorescents, notamment par l’enregistrement de leurs spectres d’émission
et d’excitation (fig. 11.9). Ils disposent de deux monochromateurs motorisés pouvant ba© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit