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Partie 1 • Méthodes séparatives
Cependant la reproductibilité des analyses est moins sure qu’en CLHP car beaucoup de
facteurs subtils peuvent affecter la répétabilité des volumes injectés. En utilisant un étalon
interne, l’écart-type relatif (CV) est de l’ordre de 2 % dans la méthode d’introduction hydrostatique. Quand l’efficacité N des séparations est suffisamment grande, il devient possible
de séparer les isotopes d’un même élément (fig. 8.11).
À la frontière de la chimie classique, l’ECHP dans sa version lab-on-a-chip intéresse
les biologistes moléculaires pour analyser les produits de PCR et de dégradation des protéines.
0
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
35
40
45
50 min
Absorbance
35 -
Cl
37 -
Cl
Figure 8.11 Séparation des isotopes du chlore.
Lorsque l’efficacité devient très grande, les isotopes d’un même élément conduisent à
deux pics bien séparés comme dans cet exemple. Conditions : capillaire de 75mm/47cm.
V = 20 kV, T = 25 ◦ C, électrolyte : chromate/borate pH = 9,2. Lucy, T. McDonald,
Anal. Chem. 1995, 67, 1074).
Les paramètres de séparation (efficacité, facteur de capacité, sélectivité, résolution) sont
accessibles à partir des électrophorégrammes en utilisant soit les mêmes formules qu’en
chromatographie, soit des formules spécifiques à l’ECHP. Ainsi l’expression classique, basée sur la seule diffusion, donnant l’efficacité N , qui peut atteindre 10
6 plateaux/mètre de
capillaire permet de calculer le coefficient de diffusion D (cm 2 ·s −1 ) du soluté choisi.
Ce dernier paramètre est relié à la dispersion s et au temps de migration t m par la loi
d’Einstein (s
2 = 2D ·t m ). On aboutit à la relation 8.7 (ou 8.8 si on élimine t m en utilisant
l’expression 8.4) :
D =
2 /2 N t m
(8.7)
ou
D =
m app
2 N
· V ·
L
(8.8)
La relation 8.8 montre que l’efficacité croît avec la différence de potentiel appliquée.
Les macromolécules, dont les facteurs de diffusion sont plus petits que pour les petites
molécules, conduisent à de meilleures séparations (fig. 8.12).
Enfin en ECHP, la résolution R entre deux pics peut être calculée en faisant intervenir
l’efficacité N , la différence de vitesse de migration entre les deux solutés et leur vitesse
moyenne (8.9) :
R =
√
N /4·
Dv
v
(8.9)
Partie 1 • Méthodes séparatives
Cependant la reproductibilité des analyses est moins sure qu’en CLHP car beaucoup de
facteurs subtils peuvent affecter la répétabilité des volumes injectés. En utilisant un étalon
interne, l’écart-type relatif (CV) est de l’ordre de 2 % dans la méthode d’introduction hydrostatique. Quand l’efficacité N des séparations est suffisamment grande, il devient possible
de séparer les isotopes d’un même élément (fig. 8.11).
À la frontière de la chimie classique, l’ECHP dans sa version lab-on-a-chip intéresse
les biologistes moléculaires pour analyser les produits de PCR et de dégradation des protéines.
0
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
35
40
45
50 min
Absorbance
35 -
Cl
37 -
Cl
Figure 8.11 Séparation des isotopes du chlore.
Lorsque l’efficacité devient très grande, les isotopes d’un même élément conduisent à
deux pics bien séparés comme dans cet exemple. Conditions : capillaire de 75mm/47cm.
V = 20 kV, T = 25 ◦ C, électrolyte : chromate/borate pH = 9,2. Lucy, T. McDonald,
Anal. Chem. 1995, 67, 1074).
Les paramètres de séparation (efficacité, facteur de capacité, sélectivité, résolution) sont
accessibles à partir des électrophorégrammes en utilisant soit les mêmes formules qu’en
chromatographie, soit des formules spécifiques à l’ECHP. Ainsi l’expression classique, basée sur la seule diffusion, donnant l’efficacité N , qui peut atteindre 10
6 plateaux/mètre de
capillaire permet de calculer le coefficient de diffusion D (cm 2 ·s −1 ) du soluté choisi.
Ce dernier paramètre est relié à la dispersion s et au temps de migration t m par la loi
d’Einstein (s
2 = 2D ·t m ). On aboutit à la relation 8.7 (ou 8.8 si on élimine t m en utilisant
l’expression 8.4) :
D =
2 /2 N t m
(8.7)
ou
D =
m app
2 N
· V ·
L
(8.8)
La relation 8.8 montre que l’efficacité croît avec la différence de potentiel appliquée.
Les macromolécules, dont les facteurs de diffusion sont plus petits que pour les petites
molécules, conduisent à de meilleures séparations (fig. 8.12).
Enfin en ECHP, la résolution R entre deux pics peut être calculée en faisant intervenir
l’efficacité N , la différence de vitesse de migration entre les deux solutés et leur vitesse
moyenne (8.9) :
R =
√
N /4·
Dv
v
(8.9)