8 • Électrophorèse capillaire et électrochromatographie
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Dans l’électrophorèse sur plaque, le support sur lequel se produit la migration peut
contenir un gel (amidon ou mieux polyacrylamide) imprégné de l’électrolyte. Si ce dernier
contient du dodécylsulfate de sodium (SDS), on désigne cette forme d’électrophorèse sur
gel par son sigle anglais SDS PAGE. La séparation se trouve améliorée par un phénomène
de filtration qui se superpose aux forces électriques. Ces techniques sont surtout utilisées
pour les trois grandes catégories de biomolécules : les polypeptides (protéines), les oligonucléotides (fragments d’ADN ou d’ARN) et les mono- et polysaccharides (hydrates de
carbone).
8.4.4 Électrophorèse à focalisation isoélectrique (CIEF)
Cette technique également connue en électrophorèse sur support, consiste à créer un gradient de pH linéaire dans un capillaire à paroi traitée contenant un ampholyte. Le capillaire
plonge dans H 3 PO 4 à l’anode et dans NaOH à la cathode. Chaque composé migre et se
focalise au pH qui a même valeur que son potentiel isoélectrique (au pI, sa charge nette est
nulle). Ensuite, sous l’effet d’une pression hydrostatique et en maintenant le champ électrique, on déplace les espèces séparées vers le détecteur. Les résolutions élevées obtenues
avec ce procédé, permettent notamment de séparer des peptides dont les pI ne diffèrent que
de 0,02 unité pH.
8.5 PERFORMANCES
Les performances de l’électrophorèse capillaire sont intrinsèquement comparables à celles
de la chromatographie liquide qu’elle complète utilement pour les séparations de biomolécules. La sensibilité est très grande : en employant un mode de détection basé sur la
fluorescence déclenchée par laser (LIF), on peut déceler quelques milliers de molécules
vraies après dérivatisation. La mise au point d’une séparation revient à trouver un milieu
tampon adapté au problème à résoudre. La quantité requise d’échantillon est très faible et
la consommation de réactifs ou de solvants est négligeable (fig. 8.10).
mobilités électrophorétiques
temps 0
temps t
anode (+)
cathode (-)
flux électro-osmotique
a + b + c
–
–
a et b
–
–
c
b
–
a
–
« DIET COLA »
caféine, aspartame et acide benzoïque
Figure 8.10 Séparation électrocinétique de trois espèces a − , b
− et c.
On a choisi ici un flux électro-osmotique se dirigeant vers la cathode et entraînant avec
lui toutes les espèces, chargées ou neutres. Les espèces négatives bien qu’attirées par
le pôle positif, ne peuvent vaincre le flux électro-osmotique et se déplacent par conséquent vers la cathode. Séparation de la caféine (c) et des anions de l’aspartame (a − )
et du benzoate (b − ), d’un échantillon de DIET-COLA ; présentation sous forme d’un
électrophorégramme 3D (reproduit avec l’autorisation de la société TSP).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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Dans l’électrophorèse sur plaque, le support sur lequel se produit la migration peut
contenir un gel (amidon ou mieux polyacrylamide) imprégné de l’électrolyte. Si ce dernier
contient du dodécylsulfate de sodium (SDS), on désigne cette forme d’électrophorèse sur
gel par son sigle anglais SDS PAGE. La séparation se trouve améliorée par un phénomène
de filtration qui se superpose aux forces électriques. Ces techniques sont surtout utilisées
pour les trois grandes catégories de biomolécules : les polypeptides (protéines), les oligonucléotides (fragments d’ADN ou d’ARN) et les mono- et polysaccharides (hydrates de
carbone).
8.4.4 Électrophorèse à focalisation isoélectrique (CIEF)
Cette technique également connue en électrophorèse sur support, consiste à créer un gradient de pH linéaire dans un capillaire à paroi traitée contenant un ampholyte. Le capillaire
plonge dans H 3 PO 4 à l’anode et dans NaOH à la cathode. Chaque composé migre et se
focalise au pH qui a même valeur que son potentiel isoélectrique (au pI, sa charge nette est
nulle). Ensuite, sous l’effet d’une pression hydrostatique et en maintenant le champ électrique, on déplace les espèces séparées vers le détecteur. Les résolutions élevées obtenues
avec ce procédé, permettent notamment de séparer des peptides dont les pI ne diffèrent que
de 0,02 unité pH.
8.5 PERFORMANCES
Les performances de l’électrophorèse capillaire sont intrinsèquement comparables à celles
de la chromatographie liquide qu’elle complète utilement pour les séparations de biomolécules. La sensibilité est très grande : en employant un mode de détection basé sur la
fluorescence déclenchée par laser (LIF), on peut déceler quelques milliers de molécules
vraies après dérivatisation. La mise au point d’une séparation revient à trouver un milieu
tampon adapté au problème à résoudre. La quantité requise d’échantillon est très faible et
la consommation de réactifs ou de solvants est négligeable (fig. 8.10).
mobilités électrophorétiques
temps 0
temps t
anode (+)
cathode (-)
flux électro-osmotique
a + b + c
–
–
a et b
–
–
c
b
–
a
–
« DIET COLA »
caféine, aspartame et acide benzoïque
Figure 8.10 Séparation électrocinétique de trois espèces a − , b
− et c.
On a choisi ici un flux électro-osmotique se dirigeant vers la cathode et entraînant avec
lui toutes les espèces, chargées ou neutres. Les espèces négatives bien qu’attirées par
le pôle positif, ne peuvent vaincre le flux électro-osmotique et se déplacent par conséquent vers la cathode. Séparation de la caféine (c) et des anions de l’aspartame (a − )
et du benzoate (b − ), d’un échantillon de DIET-COLA ; présentation sous forme d’un
électrophorégramme 3D (reproduit avec l’autorisation de la société TSP).
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit