5 • Chromatographie planaire
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5.4 PARAMÈTRES DE SÉPARATION ET DE RÉTENTION
Chaque composé est défini par son R f , (abréviation de « retardation factor »), qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant :
R =
distance parcourue par le soluté
distance parcourue par le front de solvant
=
x
x 0
(5.1)
On définit l’efficacité N de la plaque pour un composé dont la distance de migration est
x et le diamètre du spot w par la relation 5.2 et H (HEPT) par la relation 5.3 :
N = 16
x 2
w 2
(5.2)
et
H =
x
N
(5.3)
Pour calculer le facteur de rétention k d’un composé ou la sélectivité entre deux composés
on fait généralement correspondre les distances de migration sur la plaque aux temps de
migration lus sur un chromatogramme. En admettant que le rapport des vitesses u et u 0 de
migration sont les mêmes sur la plaque et la colonne (ce qui n’est qu’une approximation),
on pourra relier R f et k :
R f =
x
x 0
=
u
u 0
=
t 0
t
=
1
k + 1
soit k =
1
R f
− 1
( 5 .4)
Enfin, on pose que la résolution, à l’image de l’expression 1.26, a pour valeur :
R = 2
x 2 − x 1
w 1 + w 2
(5.5)
5.5 CCM QUANTITATIVE
Pour valider une méthode de dosage par CCM il faut non seulement disposer d’un moyen
de quantification des taches (figures 5.1 et 5.6), mais aussi définir les paramètres habituels
(spécificité, étendue du domaine de linéarité, précision...). Dans ce but, la plaque à examiner
est déplacée sous l’optique d’un densitomètre (ou scanner) qui mesure soit l’absorption soit
la fluorescence à une ou plusieurs longueurs d’onde. Cet appareil conduit à un pseudochromatogramme comportant des pics dont on peut mesurer les aires (voir par ex. figure 5.5). Il
s’agit en fait d’une image isochrone de la séparation à l’instant final. En CCM il suffit de
quelques ng d’un composé absorbant dans l’UV pour former une tache décelable.
Afin de révéler les composés marqués par un radio-isotope b
− , on dispose de densitomètres particuliers équipés d’une caméra vidéo qui donne une image de la distribution
radioactive de la plaque. L’ancien procédé d’autoradiographie par contact sur une plaque
photographique a pour défaut d’être très peu sensible (poses pouvant dépasser 48 heures).
Ces densitomètres connus sous le nom de machines de Charpak, sont également utilisés en
électrophorèse sur gel. La sensibilité est suffisante pour déceler des activités de quelques
becquerels par mm
2 .
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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5.4 PARAMÈTRES DE SÉPARATION ET DE RÉTENTION
Chaque composé est défini par son R f , (abréviation de « retardation factor »), qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant :
R =
distance parcourue par le soluté
distance parcourue par le front de solvant
=
x
x 0
(5.1)
On définit l’efficacité N de la plaque pour un composé dont la distance de migration est
x et le diamètre du spot w par la relation 5.2 et H (HEPT) par la relation 5.3 :
N = 16
x 2
w 2
(5.2)
et
H =
x
N
(5.3)
Pour calculer le facteur de rétention k d’un composé ou la sélectivité entre deux composés
on fait généralement correspondre les distances de migration sur la plaque aux temps de
migration lus sur un chromatogramme. En admettant que le rapport des vitesses u et u 0 de
migration sont les mêmes sur la plaque et la colonne (ce qui n’est qu’une approximation),
on pourra relier R f et k :
R f =
x
x 0
=
u
u 0
=
t 0
t
=
1
k + 1
soit k =
1
R f
− 1
( 5 .4)
Enfin, on pose que la résolution, à l’image de l’expression 1.26, a pour valeur :
R = 2
x 2 − x 1
w 1 + w 2
(5.5)
5.5 CCM QUANTITATIVE
Pour valider une méthode de dosage par CCM il faut non seulement disposer d’un moyen
de quantification des taches (figures 5.1 et 5.6), mais aussi définir les paramètres habituels
(spécificité, étendue du domaine de linéarité, précision...). Dans ce but, la plaque à examiner
est déplacée sous l’optique d’un densitomètre (ou scanner) qui mesure soit l’absorption soit
la fluorescence à une ou plusieurs longueurs d’onde. Cet appareil conduit à un pseudochromatogramme comportant des pics dont on peut mesurer les aires (voir par ex. figure 5.5). Il
s’agit en fait d’une image isochrone de la séparation à l’instant final. En CCM il suffit de
quelques ng d’un composé absorbant dans l’UV pour former une tache décelable.
Afin de révéler les composés marqués par un radio-isotope b
− , on dispose de densitomètres particuliers équipés d’une caméra vidéo qui donne une image de la distribution
radioactive de la plaque. L’ancien procédé d’autoradiographie par contact sur une plaque
photographique a pour défaut d’être très peu sensible (poses pouvant dépasser 48 heures).
Ces densitomètres connus sous le nom de machines de Charpak, sont également utilisés en
électrophorèse sur gel. La sensibilité est suffisante pour déceler des activités de quelques
becquerels par mm
2 .
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit