Chapitre II
Matériel et méthodes
27
- 12.9 g de dihydrogène phosphate de sodium Na2HPO4 ;
- Ajouter de l’eau distillée jusqu’à 500 ml dans une fiole jaugée de 500ml ;
- Mélanger à l’aide d’un agitateur magnétique.
Le tout a été broyé et homogénéisé à l’aide d’un broyeur 1000w
L’homogénat obtenu a été centrifugé à 3500tr\min pendant 10 min à 4°C
Le surnageant qui contient la fraction S9 a été ensuite récupéré (il contient le cytosol, le
réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi et les protéines cytosoliques) pour le dosage
de protéines totales et de l’activité CAT recherchée.
II.5.1.2 Dosage des protéines totales par la méthode de Biuret :
Afin de pouvoir mesurer l’activité de l’ enzyme catalase, il est indispensable de doser la
concentration en protéines totales dans la fraction S9 extraite de la glande digestive de notre
échantillon ,qui contient la concentration de protéines la plus cultivée des organes vitaux (foi,
appareil digestif, gonades, cœur,etc…), pour se faire ,un dosage spectrophotométrique est
nécessaire afin de pouvoir déterminer la concentration en protéines dans la fraction S9 en se basant
sur la gamme étalon qui détermine la densité optique en fonction des concentrations croissante ;
pour cela , on a opté pour l’utilisation du réactif de BIURET (GORNALL et al., 1949) pour
réaliser la lecture de densité optique des essais ,
Principe de la méthode de BIEURT :
C’est une méthode de dosage colorimétrique décrite par GORNALL et al., (1949). Les liaisons
peptidiques des protéines réagissent avec Cu
2+ en solution alcaline pour former un complexe coloré
dont l’absorbance, proportionnelle à la concentration en protéines dans le spécimen.
Le sulfate de cuivre en solution alcaline passe du bleu au bleu violacé en présence de protéines
(PERRETT et NAYUNI, 2020)
Le Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2, soit deux molécules d’urée) donne avec les ions cuivriques
(Cu
2+ ) et en milieu très alcalin un complexe qui absorbant fortement à 540nm (coloration bleu
violacée), l’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéine (liaisons
peptidiques) présente dans l’échantillon.
Le dosage par la méthode du biuret est réalisé grâce au réactif de Biuret, qui contient :
Le sulfate de cuivre : source d’ions Cu
2+ ;
L’hydroxyde de sodium NaOH permettant l'alcalinisation du milieu ;
L’iodure de potassium qui évite la réduction (gain d’électrons) du cuivre en Cu
+ ;
Le tartrate de sodium et de potassium qui forme avec les ions Cu
2+ un complexe, ce qui
empêche leur précipitation sous forme de dihydroxyde de cuivre Cu(OH)2 à pH alcalin.
Matériel et méthodes
27
- 12.9 g de dihydrogène phosphate de sodium Na2HPO4 ;
- Ajouter de l’eau distillée jusqu’à 500 ml dans une fiole jaugée de 500ml ;
- Mélanger à l’aide d’un agitateur magnétique.
Le tout a été broyé et homogénéisé à l’aide d’un broyeur 1000w
L’homogénat obtenu a été centrifugé à 3500tr\min pendant 10 min à 4°C
Le surnageant qui contient la fraction S9 a été ensuite récupéré (il contient le cytosol, le
réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi et les protéines cytosoliques) pour le dosage
de protéines totales et de l’activité CAT recherchée.
II.5.1.2 Dosage des protéines totales par la méthode de Biuret :
Afin de pouvoir mesurer l’activité de l’ enzyme catalase, il est indispensable de doser la
concentration en protéines totales dans la fraction S9 extraite de la glande digestive de notre
échantillon ,qui contient la concentration de protéines la plus cultivée des organes vitaux (foi,
appareil digestif, gonades, cœur,etc…), pour se faire ,un dosage spectrophotométrique est
nécessaire afin de pouvoir déterminer la concentration en protéines dans la fraction S9 en se basant
sur la gamme étalon qui détermine la densité optique en fonction des concentrations croissante ;
pour cela , on a opté pour l’utilisation du réactif de BIURET (GORNALL et al., 1949) pour
réaliser la lecture de densité optique des essais ,
Principe de la méthode de BIEURT :
C’est une méthode de dosage colorimétrique décrite par GORNALL et al., (1949). Les liaisons
peptidiques des protéines réagissent avec Cu
2+ en solution alcaline pour former un complexe coloré
dont l’absorbance, proportionnelle à la concentration en protéines dans le spécimen.
Le sulfate de cuivre en solution alcaline passe du bleu au bleu violacé en présence de protéines
(PERRETT et NAYUNI, 2020)
Le Biuret (H2N-CO-NH-CO-NH2, soit deux molécules d’urée) donne avec les ions cuivriques
(Cu
2+ ) et en milieu très alcalin un complexe qui absorbant fortement à 540nm (coloration bleu
violacée), l’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéine (liaisons
peptidiques) présente dans l’échantillon.
Le dosage par la méthode du biuret est réalisé grâce au réactif de Biuret, qui contient :
Le sulfate de cuivre : source d’ions Cu
2+ ;
L’hydroxyde de sodium NaOH permettant l'alcalinisation du milieu ;
L’iodure de potassium qui évite la réduction (gain d’électrons) du cuivre en Cu
+ ;
Le tartrate de sodium et de potassium qui forme avec les ions Cu
2+ un complexe, ce qui
empêche leur précipitation sous forme de dihydroxyde de cuivre Cu(OH)2 à pH alcalin.