Chapitre III : Matériels et méthodes
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C. Mode opératoire :
Etape 1 : Minéralisation :
La minéralisation permet de dénaturer les protéines (casser les liaisons) et de libérer les acides
aminés, ensuite transformer l’azote organique en azote minéral.
Elle est effectuée à l’aide d’un appareil de minéralisation « Inkjel. M, Behr labor-technik Gmbh »
équipé : d’une plaque chauffante, d’un porte matras, d’un collecteur de fumée et d’un thermostat.
Tout le système est relié à une pompe à vide qui est reliée à un piégeur de fumée.
Dans un matras de Kjeldahl (Fig. III.18, Annexe III), on met :
- 0.5g de l’échantillon de la matière organique de poisson lyophilisée, 3.5g de sulfate de
potassium K2SO4, une pincée de sulfate de cuivre CuSO4 et 1 ml d’eau oxygénée, 10 ml d’acide
sulfurique (H2SO4) concentré ;
- On agite et on place le matras dans le dispositif de minéralisation ;
- On chauffe doucement et progressivement jusqu'à l’apparition des fumées noires ;
- On poursuit le chauffage durant 30 à 45 minutes jusqu'à l’obtention d’une couleur limpide. A
la fin de la minéralisation, on laisse les matras refroidir.
Etape 2 : Filtration et dilution du minéralisât :
Après refroidissement des matras, on filtre chaque minéralisât dans un erlenmeyer. On lave le
matras et on filtre aussi l’eau de rinçage (Fig. III.19, Annexe III).
On ajuste à 100 ml, avec l’eau distillée. On transvase les minéralisât dilués et filtrés dans des
erlenmeyers colorés en brun, à bouchon. On étiquette les erlenmeyers et on les conserve au
réfrigérateur à 4° C.
Etape 3 : Distillation
On prélève dans un matras de Kjeldahl 20ml du minéralisât filtré et dilué pour la distillation.
Ensuite, on place le matras dans l’appareil de distillation « Behr, Labor-Technik ». A l’aide d’un
bouton on ajoute 40ml de la soude NaOH a 40% dans le matras et on débute la distillation.
On recueille le distillat (ammoniaque entrainé à la vapeur d’eau) dans un erlenmeyer de collecte,
contenant 20ml d’acide borique à 4% dont le pH a été préalablement déterminé (Fig. III.20,
Annexe III). On continue la distillation jusqu'à l’obtention de 100 ml de solution (acide borique +
ammoniaque entrainé à la vapeur d’eau), l’opération dure 5 à 10 min. On relève de nouveau la
valeur du pH.
Etape 4 : Titrage
On ajoute au distillat obtenu 10 gouttes de la solution d’indicateur « Tashiro »
On titre directement la solution obtenue par une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à 0.2 N
jusqu'à l’obtention du pH initial de la solution d’acide borique (Fig. III.21, Annexe III).
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C. Mode opératoire :
Etape 1 : Minéralisation :
La minéralisation permet de dénaturer les protéines (casser les liaisons) et de libérer les acides
aminés, ensuite transformer l’azote organique en azote minéral.
Elle est effectuée à l’aide d’un appareil de minéralisation « Inkjel. M, Behr labor-technik Gmbh »
équipé : d’une plaque chauffante, d’un porte matras, d’un collecteur de fumée et d’un thermostat.
Tout le système est relié à une pompe à vide qui est reliée à un piégeur de fumée.
Dans un matras de Kjeldahl (Fig. III.18, Annexe III), on met :
- 0.5g de l’échantillon de la matière organique de poisson lyophilisée, 3.5g de sulfate de
potassium K2SO4, une pincée de sulfate de cuivre CuSO4 et 1 ml d’eau oxygénée, 10 ml d’acide
sulfurique (H2SO4) concentré ;
- On agite et on place le matras dans le dispositif de minéralisation ;
- On chauffe doucement et progressivement jusqu'à l’apparition des fumées noires ;
- On poursuit le chauffage durant 30 à 45 minutes jusqu'à l’obtention d’une couleur limpide. A
la fin de la minéralisation, on laisse les matras refroidir.
Etape 2 : Filtration et dilution du minéralisât :
Après refroidissement des matras, on filtre chaque minéralisât dans un erlenmeyer. On lave le
matras et on filtre aussi l’eau de rinçage (Fig. III.19, Annexe III).
On ajuste à 100 ml, avec l’eau distillée. On transvase les minéralisât dilués et filtrés dans des
erlenmeyers colorés en brun, à bouchon. On étiquette les erlenmeyers et on les conserve au
réfrigérateur à 4° C.
Etape 3 : Distillation
On prélève dans un matras de Kjeldahl 20ml du minéralisât filtré et dilué pour la distillation.
Ensuite, on place le matras dans l’appareil de distillation « Behr, Labor-Technik ». A l’aide d’un
bouton on ajoute 40ml de la soude NaOH a 40% dans le matras et on débute la distillation.
On recueille le distillat (ammoniaque entrainé à la vapeur d’eau) dans un erlenmeyer de collecte,
contenant 20ml d’acide borique à 4% dont le pH a été préalablement déterminé (Fig. III.20,
Annexe III). On continue la distillation jusqu'à l’obtention de 100 ml de solution (acide borique +
ammoniaque entrainé à la vapeur d’eau), l’opération dure 5 à 10 min. On relève de nouveau la
valeur du pH.
Etape 4 : Titrage
On ajoute au distillat obtenu 10 gouttes de la solution d’indicateur « Tashiro »
On titre directement la solution obtenue par une solution d’acide chlorhydrique (HCl) à 0.2 N
jusqu'à l’obtention du pH initial de la solution d’acide borique (Fig. III.21, Annexe III).