Deuxième chapitre : Matériel et méthodes
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10. Technique d’identification bactérienne :
Technique de la coloration de Gram :
a. Préparation du frottis :
 Poser une goutte d’eau distillée sur une lame propre, prélever une parcelle d’une colonie
bactérienne isolée et l’étaler sur la lame,
 Sécher en approchant la lame de 15-20 cm au-dessus de la flamme du bec bunsen.
b. Fixation :
 Tenir la lame avec une pince et la passer trois fois à la flamme.
c. Coloration de Gram :
Coloration primaire :
 Couvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir 1 min, jeter l’excès de colorant.
Mordançage :
 Egoutter sans rincer et faire deux bains de lugol dont chacun dure 45 secondes.
Décoloration :
 Egoutter et plonger la lame dans l’alcool durant 15 secondes,
 Rincer doucement et abondamment à l’eau distillée.
Coloration secondaire :
 recolorer les germes décolorés avec la fuchsine pendant 1 min,
 Laver à l’eau distillée et sécher la lame au-dessus de la flamme.
d. Observation microscopique :
Observer à l’objectif à immersion (G 40 x 100) :
 Les bactéries colorées en violet sont les bactéries à Gram+,
 Les bactéries colorées en rose sont les bactéries à Gram-.